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手把手课程之WB优化,本期品牌:CST

CST-细胞信号转导研究金标准抗体供应商;
近4000种现货,拥有全面的信号通路抗体以及蛋白修饰(磷酸化,甲基化,已酸化,泛素化)抗体现货仓库。

 
首发公众号:优宁维抗体专家,
本文概述了CST厂商所推荐的操作步骤,并讨论成功实验的关键步骤。通过提供建议,帮助您在最短的时间、以最少的终端用户优化调整得到预期结果,提升免疫印迹效果。

首先,我们先来看以下3个案例(这是我们的客户根据建议所得到的结果):
 
抗体: Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb #3033
 
 
抗体:TIMP1 (D10E6) Rabbit mAb #8946
 
抗体:NT5E/CD73 (D7F9A) Rabbit mAb #13160
 
 
然后,我们来看几个WB关键步骤的建议:
 
01/ 超声破碎
 
确保整个细胞裂解并剪切染色质 DNA。
我们建议在35%-40%的功率输出条件下破碎3次,每次10秒。
 
【示例】
 
02/ 新鲜裂解液
 
相较于细胞系提取物,细胞和组织初次提取物含有更多的背景条带和降解产物。使用新鲜、经过超声处理和澄清的组织提取物可降低背景。
此外,相较于标准裂解缓冲液,在去污剂含量高的 RIPA 缓冲液中裂解,会得到组织的更彻底和均匀的裂解物。
 
【示例】
 
03/ 湿转移—最佳转膜方法

把蛋白从凝胶转移至膜上的湿转移是指把滤纸-凝胶-膜-滤纸“三明治”完全浸入缓冲液中。
使用此方法时,在浸没的情况下通过电泳转移至 0.2 μm 孔径硝酸纤维素膜,在冷却的含 20% 甲醇的转移缓冲液中转膜,70V,1.5小时。
 
【示例】
 

04/ 封闭液—含5%脱脂牛奶的 TBST

我们建议转移之后迅速在 Tris-Buffered Saline (TBS) 中洗涤膜,以便移除残留的转移缓冲液,随后在室温条件下含5% 脱脂牛奶的 Tris Buffered Saline 和 Tween® 20 去污剂 (TBST)中封闭1小时。
这一封闭步骤有助于降低非特异性一抗结合并降低背景。应避免膜封闭时间过长,因为这会掩盖抗原表位,阻止抗体结合。封闭后在 TBST 中洗涤5分钟。

【示例】
 
05/ 4℃ 过夜孵育

过夜孵育提高抗体结合一抗孵育时间会有很大的差别,具体取决于研究人员采用的操作流程。我们建议在4℃ 过夜孵育一抗。

【示例】
 
06/ 洗涤和稀释缓冲液—TBST 缓冲液产生更强的信号
我们推荐抗体稀释缓冲液和洗涤步骤使用TBST, TBST 的缓冲液比PBST 的缓冲液生成的信号更强。洗涤时间推荐的3x5分钟,这适用于一抗和二抗孵育后的洗涤步骤。

【示例】
 
07/ 二抗—在较强的封闭剂中稀释
 
我们建议在含 5% 脱脂牛奶的 TBST 中稀释二抗。因为脱脂牛奶的封闭要更强,所以基于 BSA 的稀释比基于牛奶的稀释产生的背景明显更强。
如果对免疫沉淀细胞裂解物进行免疫印迹实验,您会考虑采用构象或链特异性二抗,以避免 IgG 重链或轻链的信号。
当您的待测靶点蛋白的分子量接近50或25kDa时尤其重要,因为它们分别是免疫球蛋白重链和轻链的分子量位置。
 
【示例 
 
以上通过我们的建议,数据都较漂亮,使得客户得到了满意的结果。所以,建议大家都以上述步骤实验。

欢迎各位老师,提供优化前优化后的素材,小优采纳后,将获得U盘或计时器一个(二选一)。素材发送到邮箱(marketing@univ-bio.com),备注:姓名,单位,联系方式,样本信息,抗体信息。
 
 
CST全国授权代理—优宁维公司
 

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