完整解决方案之Mo-DCs的获取

美天旎授权代理商（上海/湖北/湖南/河南）-优宁维公司

 

树突状细胞（DCs）作为一种专职性抗原提呈细胞，是适应性免疫的基石。研究表明，基于DC的疫苗在肿瘤治疗中具有巨大的免疫治疗潜力。

在基础研究和免疫治疗中会用到大量DCs细胞，通常，我们是用单核细胞经过特定的分化/成熟步骤在体外生产DCs的，即单核细胞来源的树突状细胞（Mo-DCs）。为了获得成熟、功能性Mo-DCs（单核细胞来源的DCs），很重要的一点就是，要使用可靠的流程和可靠的试剂。

 

下面，我们来介绍一下美天旎Mo-DCs完整解决方案，包括单核细胞分选、诱导分化/成熟、表型鉴定及功能检测等过程。

 

①/ 单核细胞分离

 

使用美天旎CD14磁珠从健康供者PBMCs分选出CD14+单核细胞。用CD14-FITC抗体、PI进行流式细胞仪检测。

 

 

结果显示，分选出的CD14+单核细胞的纯度为96.8±3.8%，得率为81.3±8.8%%，活性为97.5±1.4%。

 

②/ Mo-DCs的分化、成熟

 

Day0：分离出的单核细胞(3×10⁶ cells)用3 mL的完全培养基（RPMI 1640, 2 mM L-glutamine, 1% autologous plasma），添加250 IU/mL IL-4 、800 IU/mL GM-CSF进行培养。

Day 2：从培养体系吸出1.5 mL，离心。用1.5 mL完全培养基加2倍浓度的IL-4和 GM-CSF，再添加到原培养体系中。

Day 6：从培养体系吸出1.5 mL，离心。用1.5 mL培养基（添加2000 IU/mL IL-6, 400 IU/mL IL-1β, 2000 IU/mL TNF-α, 2 µg/mL PGE₂），再添加到原培养体系中，培养24小时。

Day 7：通过流式检测成熟Mo-DCs (mMo-DCs)的活性为95.4±2.4%，得率为23%。

 

 

③/ Mo-DCs鉴定

 

形态观察：

显微镜下观察细胞形态：在day0，细胞呈球形，为正常的单核细胞。随着分化和成熟的进行，细胞的大小和颗粒度增加，在day6，细胞形态表现为未成熟Mo-DCs形态，在day7表现为成熟Mo-DCs的形态。

 

 

流式鉴定：
使用下表中所列流式抗体和MACSQuant 流式细胞仪检测细胞表面的marker和受体的表达。

 

Cell surface antigen	Clone	Fluorochrome
CD1a	HI149	PE
CD14	TUK4	FITC
CD25	3G10	APC
CD40	HB14	APC
CD54	REA266	PE
CD80	2D10	PE
CD83	HB15	APC
CD86	FM95	PE
CD206	DCN228	APC
CD197（CCR7）	REA108	APC
CD209（DC-SIGN）	DCN47.5	APC
HLA-DR	AC122	FITC
HLA-ABC	REA230	FITC

 

 

④/ Mo-DCs功能检测

 

抗原递呈能力：
用FITC-labeled dextran评估单核细胞、imMo-DCs或 mMo-DCs的胞吞能力。用流式细胞仪检测平均荧光强度（MFI）。结果表明，imMo-DCs具有最高的抗原提呈能力。

 

 

迁移能力检测：
mMo-DCs具有向CCL19迁移的能力，并呈现剂量依赖性。

 

 

Mo-DCs诱导naive T细胞增殖的能力:
我们通过混合淋巴细胞反应实验(MLR)，来评估Mo-DCs诱导naive T细胞的能力：先用Naive CD4 + T Cell Isolation Kit II从PBMCs分选出Naive CD4 + T细胞，再分别与Monocytes, imMo-DCs, mMo-DCs共培养7天，然后检测CD4 + T细胞的增殖情况，结果显示：mMo-DCs能够诱导T细胞增殖。

 

 

检测Mo-DCs分泌IL-12的能力：
用CD40L刺激后，对mMo-DCs分泌的IL-12和IL-10进行定量分析。结果表明，在CD40L的刺激下，mMo-DCs分泌IL-12。

 

 

HOHO，我们成功获得了Mo-DCs，其中所涉及的产品美天旎都有哦，快来找小旎吧。

 

上海优宁维生物科技股份有限公司

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