获得完美DNA细胞周期的关键点

DNA 细胞周期是流式细胞术非常重要的技术，它看似容易。但实际上为了获得正确的分析结果，需要记住若干关键点。

01》获取足够的事件

细胞周期分析需要用某个数学模型拟合数据，这些模型对S期、G1、G2/M 期进行了不同的假设性推算，因此，需要有足够多的数据供模型拟合。

为了获得足够的数据，从G1峰开始到G2/M峰末尾之间的每个channel均需获取到100个事件，也就是说，假如G1峰的起始处位于40000道，G2/M峰末尾位于110000道，那么应获取的事件数量应该是(110000-40000)×100=700 万个事件。

02》记得化学计量学

DNA 染料的浓度需要足量，以使其能够与细胞内的DNA 含量成正确的比例结合。因此在染色前应该进行精确的细胞计数，并确保加入正确量的DNA 染料。

03》固定很重要

交联类试剂（例如甲醛）可减少染料结合，因为它们可诱导染色质交联。脱水类固定剂（例如甲醇和乙醇）更好，但高浓度亦会造成细胞成团，并且脱水类固定剂会影响表面荧光染料。别忘了，少量去污剂可帮助改善DNA染料的结合。

04》别忘记使用RNAase

一些染料(例如PI)会同时结合DNA 和RNA，如果使用PI，必须在染色缓冲液中加入RNAse。如果不这么做，会导致DNA直方图很差。

注意CV。G0/G1 峰的CV 值是衡量DNA 直方图质量的一个标准，它可以被流速、激光校准等因素影响（见下图）流速越低，CV 值越小，所以在正确校准的机器上低速获取DNA 样本对于结果十分关键。

注意排除粘连体。粘连体容易与G2/M 期细胞混淆起来（见下图），所以需要通过以下三个方式减少其干扰：制备好的单细胞悬液；注意固定操作并记得在上样前过滤标本；确保分析时使用H、W 和A 等参数来设门排除粘连体。

05》控制细胞周期

建议在所有的实验中均加入一个DNA 细胞周期质控品，这样可以更好地确定细胞周期的改变，允许你比较不同样本/ 机器/ 日期之间的结果，以提高可重复性和可信度。最常用的质控品是鸡红细胞和鲑鱼红细胞。

总之，细胞周期是流式细胞术中非常重要的工具，但其中还是有不少需要优化的步骤，不要认为在样本中加入一些PI 就能够得到好的DNA 直方图。选择最好的固定剂、正确的染料、良好的仪器都对DNA 细胞周期非常重要。

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