ELISA 成功秘笈

 ELISA 成功秘笈，来自 R&D Systems 的专家心语

ELISA 作为经典的免疫检测方法，看起来很平常，然而真正做好它并不容易。有哪些秘笈，让 R&D Systems 的 ELISA 专家告诉你：

1. 确定您的样本类型和试剂盒可以兼容

常见样本类型有血清，血浆，细胞培养上清，如果是厂家实验验证过的，可根据产品说明购买使用。【注意：血浆制备用到的抗凝剂有 EDTA、柠檬酸盐、肝素等多种，相应的血浆性质存在差异，需单独确认兼容性】。

特殊样本，如尿液、胸腹水、脑脊液、灌洗液、泪液，组织匀浆液等，可能缺乏厂家数据支持，这并不是说试剂盒无法应用于这些样本，而是需要咨询有相关经验人士或自行实验验证可行性（如需进行掺入回收实验）。

 

2. 试剂盒检测范围需要匹配样本中标志物浓度

ELISA 试剂盒的定量检测范围需参考标准曲线，在标准曲线最低和最高浓度区间内属于线性范围，其中的值是可信和可定量的。浓度高于线性范围的样品要稀释到线性范围内来测量，而浓度低于线性范围的样品，其测量值不能用于计算浓度，只能用做参考。有一种常见的相关情况是：健康人样本中很多标志物的浓度偏低，测量值低于标准曲线最低值。

R&D Systems 的产品说明书中Sample Values部分，为您提供了检测健康人样本的结果作为对照，可用来确认您结果的可靠性。需要注意的是，由于人种、疾病及保存方法的不同，即使有时说明书等参考文献中的同类样本可以检测，也不能保证对您的样本的可测性。这种低于测量范围的样本浓度可以用 ND（not detectable），或< “标准曲线最低点浓度”（如 <3.1pg/ml，IL-6 Quantikine）来标识，并进行统计学分析。

 

3. 样本收集有讲究

以血清为例，样本收集可参考试剂盒说明书，但需注意以下要点。样本尽量用无菌管收集，避免细菌的酶类和代谢产品对结果的影响。采集过程要避免溶血，因为红细胞溶解释放的活性物质可能会影响检测。保存过程中如有沉淀，应离心后取上清液。样本若不立即测定，建议按照每次使用量分装保存在 -20℃，每次检测使用一管，即避免交叉污染和反复冻融，有能保证检测结果的平行可比性。

 

4. 实验前要准备好相应试剂

提前将所有试剂平衡到室温环境，这个过程大致需半小时左右。洗液是浓缩液，如有结晶析出，需完全溶解后再进行稀释。A、B 两管显色底物在使用前15分钟按 1:1 配成混合液。为保证蛋白标准品溶液配制质量，蛋白标准品为冻干粉，重溶前需将管子离心，加入说明书指定的缓冲液，慢速在摇床上摇匀或颠倒混匀，至少 15 分钟，不建议用枪头吹打。溶解后如需保存，按每次使用量分装后根据说明书要求的温度保存。梯度稀释蛋白标准品时，建议用聚丙烯管（对蛋白吸附力很低），每步都要充分混匀且更换新枪头，确保梯度准确性。

 

5. 仪器设备的准备也必不可少

相关设备包括移液器、洗板机/摇床和酶标仪。移液器的准确性对于ELISA实验结果的可靠性十分关键，需要确保定期校准维护。摇床的使用是为了让反应体系快速达到平衡，获得稳定、可重复的结果。不用摇床对实验通常的影响是，OD 值低，CV 大。酶标仪等设备使用前提前 15 分钟开机预热。

 

6. 预实验：通常预实验包括全部标准曲线和小量样本。

预实验有两个主要目的，一来是熟悉实验流程，发现可能忽略的问题；二来是测试样本和试剂盒是否匹配，一旦出现不匹配的情况，不至于浪费过多样本。另外是对样品中目的分析物的丰度作一下大致了解，以确定合适稀释度。

 

7. 剩余的试剂盒材料要妥善保存

标准品分装后按说明书要求的温度保存，这样可以避免污染，对要求冷冻保存的标准品还可以避免反复冻融；酶标板放回锡箔纸袋，加入干燥剂，封紧封口，4℃保存。忌未将酶标板完全平衡至室温，就放回锡箔纸袋，因为此时由于温度差，酶标板上会有水汽，不利于稳定保存。

 

8. 加样要快速准确，避免气泡

加样时间宜控制在 15 分钟内。加样前要将样本混匀，特别是冻存后融化的样本（自然融化的血清等样本会有分层现象），应上下颠倒充分混匀，注意动作轻缓，避免产生气泡。如冻存融化后的样本有沉淀，可以再次离心。整个加样过程都要注意避免产生气泡。气泡会影响蛋白的相互结合，而影响反应进行。

 

9. 孵育时要保证温度均匀，防止挥发变干

孵育时压紧封口膜。多块板一起实验时，要平放各板，不要叠放，以免因温度不均造成漂移或边缘效应。

 

10. 洗板机的应用

使用洗板机，不但可以降低劳动强度，而且有利于保证 ELISA 测试的稳定性。目前的全自动洗板机不但具有很多实用的洗涤动作，如底部冲洗，两点吸液，震动，交叉吸液；还可以根据需要调节冲洗压力，冲洗距离，冲洗时间等参数。通过优选这些动作和参数，能保证良好的洗涤效果。洗板机的性能对于结果准确性影响也很大，好的洗板机要保证洗板后的残留液尽可能的少，一般不超过 2μL，以洗涤后用人工拍板垫纸不湿为准。应定期检查抽吸针头是否堵塞。洗液如果含有吐温，应随用随配。

 

11. 手动洗板的操作指南

加洗液要快速，没有多道移液器可以使用洗瓶。洗液应新鲜配制，以免被其他试剂污染，或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水纸上拍板，选用无粉尘和碎屑的优质吸水纸。需要用力拍板，使孔内没有可见液体挂壁；但也不能太重，不能让样品干太久。酶标板拍干后立即做后续的加液。

 

12. 显色反应的关键点

ELISA 实验是个酶促底物显色反应，随时间增加，显色变深，所以选择最佳时间终止反应是得到准确的标准曲线和样本浓度的重要因素。终止过程要完全。使用的 TMB 底物时完全终止点是黄色，不会有任何程度的蓝色或绿色，终止过程中必要时可以震荡 96 孔板，或用枪头抽吸混匀（终止液含强酸，避免腐蚀）。

 

13. 数据分析

按照说明书推荐的数据分析方法做曲线拟合及分析。说明书中的标准曲线是在厂商的实验室中，由非常有经验的操作人员得到的结果。客户的标准曲线和说明书中的标准曲线可能存在不同，但不等于不好。通常判断标准曲线合格的标准为：背景OD 值 <0.2；最高点 OD 值>1.0；相关系数 R2 接近或等于 1。只要满足这些条件的标准曲线都是可以使用的。

 

结语
当您了解并掌握了 ELISA 实验的这些独门秘笈，离做出最棒的 ELISA 就只有一步之遥了，接下来不妨到 R&D Systems 业界金标准的 ELISA 试剂盒中挑选一款适合您的产品，去获得稳定可靠的实验数据喽。