细胞凋亡overview
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为程序性细胞死亡 (Programmed Cell Death) 是机体主动的、高度有序地清除无用细胞的过程。 ![]() 凋亡是个多事件的信号通路过程:
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Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,对PS有高度的亲和性。可在Annexin V上偶联荧光素检测凋亡早期发生的PS外翻。由于死亡的细胞膜通透性增加,可用膜不通透性核酸染料结合DNA,区分死细胞。
![]() 流式实验结果图:
![]() Annexin V实验注意事项:
1.保证细胞活性:避免用力吹打,避免胰酶消化时间过长,遇冷PBS清洗,缩短上机时间,可上机前5min再加核酸染料
2.EDTA尽量避免使用
3.结果分析需依据对照比较。
4.药物、病毒、质粒可能对细胞本底荧光都有影响。
5.左上象限一般是由于处理方式不当,或处理时间太久导致的非凋亡途径的细胞死亡,左上象限出现大量细胞,需要优化处理的浓度和时间梯度,以及优化细胞培养,细胞消化流程。
![]() 正常线粒体膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生ATP的前提,是维持线粒体功能所必需,而凋亡过程中一个重要的变化即是线粒体膜电位的变化。
实验结果图:
![]() 实验注意事项:
1. 37℃ CO2培养箱中孵育。
2. JC-1现配现用。
3. pH的变化影响膜电位,保持平衡染液中pH的一致性。
4. JC-1会与蛋白结合,降低染料的浓度,引起假去极化。
5. 红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。
细胞凋亡过程中,胞内主要蛋白通常被降解,调节这一过程的蛋白叫做Caspase(半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶) 实验结果图:
凋亡晚期DNA内切酶活性被激活升高,双链DNA在核小体之间切断形成~185bp为基数的有序片段。Tunel流式法:通过在核酸片段末端标记优势计算凋亡百分比。 ![]() 通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP (多为dUTP)接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。
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