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从最基础的样本提取就足以位居业界翘楚，详细解密微生物核酸纯化
珠磨研磨技术与IRT技术 MO BIO在微生物核酸纯化的研究领域，有其重要的地位。那么MO BIO有什么独到之处呢？首先，简要介绍一下MO BIO的前生今世。QIAGEN于2017年收购MO BIO。收购后其原有货号依然不变哦！QIAGEN一直被业界视为提取金标准，现在与MO BIO的核心技术双剑合璧，强者更强！
MO BIO--多样的研磨珠方案和IRT技术
首先，介绍一下珠磨研磨技术 ▼
在MO BIO产品系列中，针对不同的样本类型设计了不同的研磨珠方案，主要包含以下几种研磨珠类型： 0.15mm 石榴石研磨珠 这类细沙状的研磨颗粒具有的毛边特别适合对细胞壁的破碎，同时也不容易造成DNA的断裂。常用于对微生物培养物或来自水体，尿液、血培养的菌体沉淀物。 0.25mm 碳化硅研磨珠 这类研磨颗粒的形状呈薄片状，具有锋利的边缘。不但能有效的切开微生物的细胞，同时能切断基因组DNA，因此这种研磨颗粒会用于RNA的提取试剂盒中。 0.1mm 玻璃研磨珠 这是所有研磨珠中最细小的研磨颗粒，外形呈球形。由于玻璃研磨珠的质地格外坚硬，因此特别适合于一些高强度的破碎。这种研磨珠常用于某些质地坚硬的土壤样本，例如黏土、沉积土或沙土。对于样本中的真菌和孢子都能有效破碎。 0.5mm 玻璃研磨珠 这类研磨珠与前述的0.1mm玻璃研磨珠相似，只是颗粒的直径更大，在破碎中提供的破碎力度更大，适合用于一些质地坚硬的样本。这种研磨珠主要方便客户根据自己的样本自行搭配尝试。 0.7mm 石榴石研磨珠 这种研磨颗粒的外形不规则且边缘锋利，适合用于任何半固体的介质或颗粒。MO BIO最有名的土壤DNA的提取试剂盒DNeasy PowerSoil Kit (货号12888) 中就使用的这种研磨珠。 2.38mm 不锈钢研磨珠
** 除了常见的涡旋仪(要求最大速度达到3200 RPM)，还有通量更高的QIAGEN TissueLyser II，最高可同时处理2x96份样本。 应用举例 为了研究不同的裂解方案对于土壤中总DNA提取质量的影响，研究人员利用两种不同的土壤样本分别采用两种破碎方案提取DNA，并对结果进行了评估。
样本和方案 样本A：样本成分45%黏土，2.5%碳，pH8 样本B：样本成分40%黏土，4.9%碳，pH8 破碎方案：土壤上样量250mg。分别0.1mm玻璃和0.7mm 石榴石这两种研磨珠，在2000RPM到5000RPM不同速度下破碎45s，比较获得的DNA的产量和完整性。
研究结果 1. 针对样本A，0.1mm玻璃研磨珠的DNA产量高于石榴石研磨珠，且在3900-4200RPM范围内，DNA的产量随着振荡速度的提高而增加；超过4200RPM后，DNA产量下降。 2. 针对样本B，低速时，两种研磨方案的结果相当。0.1mm玻璃研磨珠在低速（约2000RPM）的提取结果最佳；而石榴石研磨珠在3200RPM时的产量和完整性最好，超过3200RPM后，DNA的片段化程度加重。
1. 针对黏土含量高，有机质含量低的土壤样本最好选用0.1mm的玻璃研磨珠，同时此类样本需要更高速的破碎条件； 2. 有机质含量高的土壤样本在低速破碎条件下，两种研磨珠的效果类似，但在高速条件下，DNA断裂严重，如果使用石榴石研磨珠，最高研磨速度不要超过3200RPM。 3. 因此在实际操作中，如果发现DNA产量和完整性不佳，需要研磨珠和破碎速度进行优化，既可以获得较好的提取效果。
接下来，给大家介绍一下IRT技术▼ MO BIO专利的抑制因子去除技术(Inhibitor Removal Technology®, IRT)是全球公认的能有效去除腐殖质、多酚和多糖等抑制因子的特有专利技术。 在MO BIO的产品名中凡是存在“Power”一词的试剂盒，都应用了IRT技术。
✔ Buffer 1 可溶解DNA并沉淀蛋白质 ✔ Buffer 2 则结合并沉淀腐殖质、多聚糖等大分子物质。
如下图可见，研磨后的浑浊样本，经IRT技术处理后，最终得到透明净澈的上清液(D)，这说明该技术处理能有效去除杂质。
实验一 实验方案 • 用含有IRT技术的DNeasy PowerSoil® Kit(简称P)和不含IRT技术的其他厂家试剂盒(简称C)分别对0.1g堆肥样本进行DNA的提取，并对产物进行终点法PCR和电泳检测。
1. A260结果显示，C得到的DNA产量几乎是PowerSoil®(P)的两倍；但从电泳结果明显看出，C的产物有不同程度的降解，这说明由于DNA/RNA的降解导致了C的A260值虚高。 2. C的A260/230的比值都偏低而A340值则偏高(Fig 1B)，这说明C的产物中含有抑制剂的残留。PCR产物电泳结果也进一步验证了这一点(Fig 1C)。
实验二 实验方案 • 将50ml水样用0.45μm MCE滤膜过滤，滤膜的DNA分别用含有IRT技术的DNeasy PowerWater® Kit和不含IRT的普通提取试剂盒进行提取。利用通用的16S rRNA引物进行real-time PCR。用纯化后的粪肠球菌DNA梯度稀释后做标准曲线进行定量。
实验结果 1. 普通试剂盒提取的DNA从电泳图条带分析，浓度应稍高于PowerWater®(Fig 2A)。 2. 但qPCR结果显示，无IRT技术的样本不但扩增的起峰更晚，而且样本扩增的重复性也非常差(Fig 2B)。这说明产物中残留的抑制剂极大的影响了real-time PCR的结果。
实验三 实验方案 • 0.15g生物被膜在用RNeasy PowerBiofilm Kit进行RNA的提取时，两组样本采用相同体积的IRT Buffer 1处理，但分别用100μl和200μl的IRT Buffer 2处理。所获的RNA经逆转录成cDNA后，利用终点法PCR对产物进行检测。
实验结果 1. 200μl IRT Buffer 2处理得到的RNA产量相比100μl Buffer 2的稍少一些(Fig 3A)。 2. 但经过两步法RT-PCR后，两种方案所得的产物结果差异明显，100μl Buffer 2方案由于抑制剂残留使PCR受到影响，尤其1a最明显(Fig 3B)。 3. 利用DNeasy PowerClean Clean Up Kit优化后的步骤对1a样本再一次纯化，结果显示抑制剂被去除，PCR扩增得到有效提升(Fig 3C)。
结论 ★ 环境样本中残留的大量腐殖质是影响DNA/RNA提取质量的重要因素; ★ MO BIO专利的IRT技术含有的两种Buffer能有效去除样本中的抑制剂，并整合到任何样本的核酸提取步骤中; ★ IRT处理后的DNA无论从产量的稳定性和qPCR的灵敏度上都有极大的提升; ★ 针对一些高含量抑制剂样本，如某些生物被膜，可能需要优化IRT中Buffer 2的用量，以进一步提升PCR扩增性能。
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