Tubulin蛋白及微管聚合研究方法

微管显微镜示意图

☆微管蛋白有什么研究意义呢？

由于微管在细胞分裂过程中的重要作用, 微管蛋白已经成为研究与开发全新抗癌药物的重要靶点之一, 作用于微管系统的微管蛋白抑制剂也已成为一类有效的抗肿瘤药物。该类抑制剂的作用机制是通过抑制微管蛋白的聚合 或者促进微管蛋白的聚合而干扰细胞的有丝分裂过程, 从而发挥抗肿瘤作用。

Tubulin-α、β为微管主要组成成分

目前微管聚合的研究方法主要分为两种：

（1）基于荧光分析（DAPI荧光基团）的新型聚合分析方法

（2）基于吸光度（光散射）的经典型分析方法

两种方法比较：

这里小优就为刚入门的小伙伴介绍经典的微管聚合分析方法~

该方法是基于光散射原理，激发光透过微管会发生散射，其散射程度与微管聚合物的浓度在一定范围内成正比。根据这一原理我们便能通过检测样品吸光度从而监测微管的聚合。实验结果表现为聚合曲线，该曲线将聚合过程分为3个阶段：成核期，生长期，和稳态期。聚合反应对聚合增强剂（paclitaxel，MAPs）与聚合抑制剂（nocodazole）高度敏感。因此，我们可根据相应聚合曲线验证药物对微管聚合的功效。该分析方法已被应用于发现有抗癌潜力的新型化合物的研究中。

标准微管蛋白聚合曲线

I：成核期；II：生长期；III：稳态期。

在紫杉醇（paclitaxel）（聚合增强剂）与诺考达唑（nocodazole）（聚合抑制剂）作用下的聚合曲线。

该微管蛋白分析方法和相关试剂盒已被广泛引用于热点研究与高分文献中。

从二十一世纪初至今，对植物真菌杀菌剂的研究一直为工业农业化学领域中的热点课题。传统的真菌杀菌剂基于琥珀酸脱氢酶抑制剂（SDHI's）作用。最近，微管蛋白聚合增强剂作为一种新型杀菌剂，其相关研究逐渐成为热门。

本篇文章发现，咪唑（imidazoles）可大幅增强真菌的微管聚合过程，扰乱其微管形成动力学，从而起到抑菌杀菌的作用。根据这一机制，咪唑可作为一种新型杀菌剂。该文章已发现其杀菌活性对几大重要植物真菌，如葡萄孢菌、球腔菌、链格孢菌等有极高活性。该文章设计了简便的4步合成路线，为咪唑的商业化生产提供了技术基础。

咪唑9合成路线（TosMIC-based）

为验证该途径合成的imidazoles具有促进微管蛋白聚合的作用，以及比较合成的imidazole9与imidazole17（氟原子被甲氧基替代）的活性差异，该文章运用了微管聚合作用分析方法。

具体实验步骤如下：

1. 酶标仪参数设置：推荐使用Molecular Devices SpectraMax 250全波长酶标仪。吸收波长340nm，温度37℃；61个循环读数每分钟；反应开始时环形震荡5秒；反应体系为100ul，酶标仪光路径长度为0.5cm。

2. 准备反应试剂：将96孔板37℃预热30min；室温预热General Tubulin Buffer；用上述buffer稀释GTP stock1：1000，该稀释液称为G-PEM Buffer；准备Tubulin微管蛋白，溶解冻干粉至4mg/ml。

3. 准备imidazole9/17的10x样品（溶解于G-PEM Buffer中）

4. 准备空白对照：Tubulin溶于G-PEM Buffer。

5. 准备增强组对照：Tubulin加10uM paclitaxel。

6. 开始聚合反应：在37℃预热的96孔板上加入空白对照组，增强组，与样品组，37℃孵育2min后在相应孔内加入100ul Tubulin启动聚合反应，立即将96孔板放入设置好的酶标仪中开始计数。

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微管的聚合与解聚存在动态不平衡性（dynamic instability），这一特性调控了细胞形态、细胞运动、物质运输、信号转导等生物学功能。胞内微管的调控失常往往引起各种疾病，例如神经退行性疾病。许多细胞质蛋白被报道与调控微管形成有关，但其具体机制大多还不知晓。

本文发现了一种之前未报道过的新型基因granule cell antiserum positive 14 (Gcap14)，其表达的Gcap14蛋白可特异性结合微管并调控其成束。其中所用的方法有体外微管共沉淀分析（in vitro MT-cosedimentation assay）。

具体方法如下：

1. Gcap14重组蛋白在E. coli. BL21中表达，表达载体pMAL-c2为其接上maltose binding protein（MBP）标记。

2. 使用亲和层析法纯化Gcap14重组蛋白，使用麦芽糖树脂柱先吸附MBP-Gcap14重组蛋白，再用3mM麦芽糖洗脱。SDS-PAGE验证纯化产物。

3. 纯净产物Gcap14重组蛋白与Triton X-100，GTP，Paclitaxel混合，加入微管蛋白二聚体（Pure procine brain tubulin dimer, ＞99% purity）进行聚合反应。

4. 聚合形成的微管（porcine brain MTs）与重组蛋白混合孵育，后用SDS-PAGE验证其结合。

用荧光标记的微管蛋白二聚体（HiLyte 488 dye-conjugated porcine brain tubulin dimer）重复上述聚合反应，加入Gcap14重组蛋白孵育，用共聚焦激光显微镜观察荧光微管成束情况。

Gcap14与MTs的结合验证。（A）MBP与MBP-Gcap14重组蛋白SDS-PAGE结果。（B&C）体外MT共沉淀分析结果。P: precipitates; S:supernatants。星号标记为沉淀的MTs。

用荧光标记的微管蛋白二聚体（HiLyte 488 dye-conjugated porcine brain tubulin dimer）重复上述聚合反应，加入Gcap14重组蛋白孵育，用共聚焦激光显微镜观察荧光微管成束情况。

体外MT成束分析。荧光标记的微管与单纯MBP和MBP-Gcap14混合孵育。箭头标记为成束的MT微丝。

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