多重免疫组化花式搞定方案

免疫组化(IHC)是利用抗原抗体的特异性反应，在形态学进行蛋白质表达定位和定量的检测方法。由于抗体的特异性不断提高，临床肿瘤标记物相关研究的不断深入，免疫组化在肿瘤的诊断和鉴别领域发挥越来越大的价值。

随着蛋白标记物研究需求的增长，科研领域和临床诊断都出现了多指标免疫组化的需求，因此多重免疫组化技术应运而生。

多重免疫组化技术经历了数次迭代，由ABC复合物法、S-P复合物法逐渐过渡至如今常用的惰性多聚物法和酪酰胺信号放大技术(TSA)。今天小优带您一起了解TSA技术的神奇之处！

1、TSA在大肠癌模型表征肿瘤及免疫细胞

Mihaela Angelova等人2018年在Cell期刊发表了一篇文章，关注大肠癌肿瘤模型，通过分析肿瘤细胞的基因组特征、蛋白质表达等，揭示了在时间空间维度下肿瘤微环境在不同转移器官中调控肿瘤发生发展的原理及过程。

大肠癌中免疫细胞的多色免疫荧光组化结果

文中采用的多色免疫荧光组化实验步骤：

样本：4μm的FFPE组织切片

重新水化：梯度乙醇

固定：NBF(10％中性缓冲福尔马林)中固定20分钟

抗原修复：微波处理，根据所检测的蛋白，采用pH=6或pH=9的抗原修复液

多重荧光组化抗体的孵育：每支抗体室温孵育30分钟

anti-CD3 (Dako M7254 clone F7.2.38)

anti-FoxP3 (CST 98377S clone D2W8E)

anti-CD20 (Dako M0755 clone L26)

anti-PDL-1 (Biocare Med ACI3171A, C clone Cal10)

anti-Ki67 (Dako M7240 clone MIB-1)

anti-pan cytokeratin (Dako M3515 clone AE1/AE3)

蛋白封闭：每支抗体孵育的环节，采用无血清蛋白封闭15分钟

HRP标记聚合物的孵育：兔/鼠HRP标记聚合物室温孵育15分钟

TSA荧光染料孵育：室温孵育10分钟

Opal 520、Opal 540、Opal 570、Opal 620、Opal 650、Opal 690

抗原修复：每个荧光染料孵育后，进行微波处理，抗原修复液pH=6/pH=9，去除上一轮染色的复合物残留

复染：DAPI室温孵育5分钟

2、TSA在大肠癌模型中表征T细胞亚群

北京大学张泽明等人2018年在Nature期刊发表了一篇文章，同样关注的大肠癌病理模型，通过12位大肠癌患者11138个T细胞的单细胞转录组分析数据，鉴定并分析了大肠癌模型中20个T细胞亚群之间的动态功能和克隆关系。

RORγ+ Treg细胞的三色免疫荧光组化结果

文中采用的多色免疫荧光组化实验步骤：

样本：FFPE组织切片

抗原修复：pH=6抗原修复液，15分钟

封闭：室温封闭10分钟

抗体孵育：

rabbit anti-human CD3 (Abcam, clone SP7, 1:100)

rabbit anti-human RORγ (Abcam, 1:50)

mouse anti-human FOXP3 (Abcam, clone mAbcam22510, 1:100)

HRP偶联二抗孵育：室温孵育10分钟

信号放大：TSA工作液，室温孵育10分钟)

TC, TH和Treg细胞的四色免疫荧光组化结果

rabbit anti-human CD3 (Abcam, clone SP7, 1:400)

rabbit anti-human CD4 (Abcam, clone EPR6855, 1:400)

mouse anti-human CD8 (Abcam, clone 144B, 1:500)

mouse anti-human FOXP3 (Abcam, clone mAbcam22510, 1:500)

CD8+ TEX细胞多色免疫荧光组化结果

rabbit anti-human TIM-3 (Cell Signalling, clone D5D5R, 1:100)

mouse anti-human Ki67 (Abcam, B126.1, 1:200)

mouse anti-human PD-1 (Abcam, clone NAT105, 1:200)

mouse anti-CD8 (Abcam, clone 144B, 1:200)

3、TSA在胃癌模型表征肿瘤及巨噬细胞

七色来了！七色免疫荧光组化，荧光panel需精心搭配调试，设备需满足多通道滤光片、多层扫描和多层融合的条件，且搭配高端的图像分析软件。先看文献，设备和软件后续都有推荐~

Alex Boussioutas等人2019年在Nature Communications期刊上发表一篇文章，通过56例人类胃癌的多重免疫组织化学结果，探讨了肿瘤微环境与肿瘤相关巨噬细胞异质性之间的关系。

肿瘤相关巨噬细胞与PD-L1的共染多色荧光组化结果

文中采用的多色免疫荧光组化实验步骤：

样本：4 μm的FFPE组织切片

抗原修复：高压125℃条件，采用pH=8的EDTA修复液孵育3分钟

多重荧光抗体孵育：每支抗体室温孵育30分钟

CD163 (Cell Marque, MRQ-26, 1:500)

CD68 (Leica Biosystems, 514H12, 1:100)

CD206 (Abcam, Ab64693, 1:6000)

IRF8 (Santa Cruz, E-9, 1:3000)

PDL1 (Spring Bioscience, SP142, 1:2000)

multi-cytokeratin (Leica Biosystems, NCL-L-AE1/AE3, 1:200)

CD163之后的抗体孵育，采用pH=8的EDTA修复液，微波15分钟条件进行抗原修复

HRP标记二抗的孵育：兔/鼠HRP标记二抗(1:1000)室温孵育10分钟

TSA染料孵育：1:50室温孵育10分钟

Dye 540、Dye 570、Dye 620、Dye 650、Dye 520、Dye 690

复染：DAPI室温孵育5分钟

1、抗体

作为行业内专注抗体产品十余年的抗体专家，优宁维持续为科研工作者提供最优质的抗体产品。

免疫组化抗体产品详见：https://ihc.univ-bio.com/ihc-home.html.

2、多色免疫组化试剂盒

优宁维提供优质的多色免疫组化即用型试剂盒，从三色两指标到七色六指标一应俱全，满足不同的实验需求。（详情请见）

3、多色免疫组化实验室服务

优宁维提供优质可靠的mIHC实验服务，可完成最多四指标五色(含DAPI)，样本涵盖人、小鼠、大鼠的石蜡切片及组织芯片(TMA)，并提供全片扫描和区域分析。诸多人和小鼠的检测蛋白指标，有已验证抗体的实验方案，最大程度减少预实验摸索条件的时间和经济成本。

已验证人/小鼠IHC指标

更多实验室服务详情请见：爱必信多色免疫组化服务

4、图像扫描设备

优宁维提供江丰全自动数字病理扫描仪，以高精度数字化病理切片扫描仪代替传统的显微镜，将实物切片转换为数字图像并进行智能分析，实现传统病理切片的数字信息化。同时病理切片的成像不再局限于一个显微视野，可实现完整的全片扫描，信息更丰富，图像更高清。更有明场，荧光不同机型，5片，20片，120片，400片等多种通量可供选择。

更多设备详情请见：听说江丰数字化病理扫描仪来了

5、图像分析软件

优宁维提供HALO精准病理图像分析软件，HALO被用户誉为定量病理分析金标准，可以精准快速分析多种病理图像——从H&E染色，免疫组化 (IHC)，到免疫荧光化学(IF, ICC)，荧光原位杂交(FISH)，原位杂交(ISH)，广泛应用在肿瘤、神经科学、代谢、眼科、皮肤、心血管等各种领域，应用的案例也包括药效、毒理、生物标记物的分析、疾病机制的研究、患者分层以及靶点评估等等。

软件详情请见：顶尖病理图像分析平台，精准信息一瞬送达

6、两色免疫组化试剂盒&辅助试剂

优宁维代理品牌Enzo Life Sciences，提供优质的两色免疫组化试剂盒。

ENZ-KIT181包含HRP和AP显色体系试剂，可在同一检测样本完成两色及以上的免疫组化实验需求。

优宁维提供完整的IHC辅助试剂方案，助力您的免疫组化实验。