原代细胞不好养，东西都选对了吗？

直接从人或动物组织中直接分离单细胞并在体外培养的细胞；是非变异的、非永生化的细胞。

原代细胞有一定的生命周期，繁殖到一定代次（一般是10代以内）就会停止生长。一般认为：原代培养的第1代到第10代以内的细胞都认为是原代细胞。

科研中，细胞系使用很广泛，使用只需要：传代和保种。由于细胞系长期体外培养传代，往往已经发生异倍化，具有异倍体核型，失去了原有的生物相关性，对药物等刺激的反应差别很大，因此并不能真实反应原始细胞生理状态。

原代细胞就具有更好的生理活性，更能反映人或动物体内的细胞真实反应。

● 在无菌条件下剔除坏死组织和包膜，无菌冲洗3-5次，剪碎约1mm3组织块

● 加入2mmol的EDTA，摇匀后放置冰上约30-60min

● 离心，加入胶原酶消化（含消化酶）

● 37℃培养箱消化，每15min摇晃一次，不同组织消化时间不同，约1-2h

● 消化成透明状时，用40um细胞滤网过滤细胞

● 用培养基重悬，置于培养箱培养

（一） 拆封和存储说明

● 对于增殖细胞 - 用70％乙醇或异丙醇擦拭细胞培养瓶，然后将培养瓶置于37°C，5％二氧化碳，潮湿的培养箱中，平衡3至4h。细胞平衡后，从培养瓶中移除培养基，更换成新鲜的培养基

（二） 解冻细胞/开始培养

● 铺板密度是3500细胞/cm2

● 不要将细胞直接铺在冻存的培养皿中。加适量的培养基在容器中（1mL/ 5cm2），让容器在37℃，5％ CO2潮湿的培养箱中至少平衡30min

● 不要离心从冷冻保护剂中移走细胞。这个操作比培养物中有DMSO残留物更具有损害性

（三） 开始培养

● 细胞长至70％到80％并包含许多有丝分裂相时进行传代培养

● 每个25cm2的细胞进行传代培养：

✔ 解冻2mL胰蛋白酶/ EDTA并至室温

✔ 加入7-10mL HEPES缓冲液（HEPES-BSS）至室温

✔ 加入4mL胰蛋白酶中和溶液（TNS）并至室温

✔ 从4°C冰箱中拿出生长培养基，并恢复到室温

✔ 准备新的培养瓶

●  一次传代1个培养瓶。第一个培养瓶之后的所有培养瓶都会按照这个步骤根据计算的细胞数，细胞活性和接种密度优化来将进行传代培养

（四） 接种细胞

● 从1个培养皿中吸出培养基

● 用5mL室温HEPES-BSS冲洗细胞。不要忘记这一步。培养基含有复杂的蛋白质和钙会中和胰蛋白酶

● 从培养瓶中吸出HEPES-BSS

● 用2mL胰蛋白酶/ EDTA溶液覆盖细胞

● 用显微镜检查细胞层

● 让胰蛋白酶继续消化直至大约90％的细胞分离。整个过程大约需要2-6min，取决于细胞类型

● 此时，用手掌轻敲培养瓶来从培养基表面释放大部分细胞。如果只有少数细胞分离，你可能没有让他们胰蛋白酶消化足够时间。等30s再次轻敲。如果细胞还是没有分离，每30s轻敲一次

● 细胞分离后，用4mL室温TNS中和胰蛋白酶。如果大多数细胞在7min内不分离，胰蛋白酶不够温暖或者活性不足以分离细胞。

如上所述收集细胞，并重新用新鲜，温暖的胰蛋白酶/ EDTA溶液或用TNS冲洗，然后在培养瓶中加入新鲜，温暖的培养基并放回到培养箱中直至新鲜的胰蛋白酶消化试剂可用

● 快速将分离的细胞转移到无菌的15mL离心管中

● 用最终的2mL HEPES-BSS冲洗培养瓶并收集残留的细胞，并把这个冲洗液加入到离心管中

● 在显微镜下回收的培养瓶，以确保回收成功。通过查看剩余的细胞数量，应该低于5％

● 将收获的细胞以220×g离心5min来沉淀细胞：吸除大部分上清液，留下100-200μl；用手指轻弹冷冻管以使沉淀松散

● 用2-3mL生长培养基稀释细胞，注意稀释的细胞悬浮液的总体积

● 使用血细胞计数器和台盼蓝确定细胞数量和活性。请记录你的细胞数量以供接下来使用

● 如有必要，用HEPES-BSS稀释细胞悬浮液以达到理想的“细胞/ mL”并重新计数细胞

● 使用以下等式来确定活细胞数量的总数

● 通过使用以下等式确定需要接种的培养瓶总数。需要的培养瓶的数量取决于细胞产量和播种密度。如果接种到孔板中，建议密度为10,000细胞/ cm2

● 使用以下等式计算接种到培养瓶中细胞悬浮液的体积

● 准备培养瓶并标记传代数，菌株数，细胞类型和日期

● 小心地将生长培养基转移到新的培养瓶中每5cm2培养瓶表面积加入1mL生长培养基（1mL/ 5cm2）

● 5mL移液管混合稀释的细胞来确保均匀悬浮，分配计算好的体积到准备好的传代培养瓶中

● 如果不使用通气盖，请松开培养瓶盖。将新培养瓶放入37°C，含5％CO2的潮湿的培养箱中

（五） 维持培养状态

● 接种后的第二天更换生长培养基，之后每隔一天更换一次培养基。当细胞变得更融合，增加培养基的体积：在25％汇合度时每5cm2接种1mL细胞，25-45％汇合度时每5cm2接种1.5mL细胞，超过45％融合度时每5cm2接种2mL细胞

● 在无菌的水浴锅中将适量体积的培养基升温至37°C。移除培养基然后用温暖的新鲜的培养基来替换然后把培养瓶放回培养箱中

● 避免反复加温和冷却培养基。如果一个步骤不需要全部的培养基，只转移所需体积到无菌的二级容器

原代细胞的提取是非常复杂的过程，每一批提取的细胞差异性很大，没法做到很好的重复性，特别是一些珍贵的人或动物样本就更难获取，提取到的细胞培养过程中会遇到细胞污染、提取的细胞数量少、杂细胞过多、培养环境难筛选、培养代次少、细胞状态不好等这些问题。如何避免这些问题？每个人操作差异性大，难免会遇到各种问题，耽误实验进展。

在这里，选择商品化的原代细胞，可以给实验提供充足的保证，节省时间和精力。

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● CoA文件提供捐献者相关信息和细胞相关性能指标

● 包含悬浮细胞和贴壁细胞

❶ Lonza和医院、组织库建立良好的合作关系，每个原代细胞都可溯源

文件号TAN :  The sequential number given to a tissue (donor) when it arrives for internal tracking purposes

所有组织有以下相关捐献者信息：

♦ 一些捐献者相关信息，比如年龄、性别、种族等

♦ 其他可能提供的额外信息，比如是否吸烟、是否饮酒、糖尿病、心脏疾病、高血压、哮喘等

❷ 每个细胞出厂质检报告CoA: Certificate of Analysis

❸ 每个原代细胞筛选的原代细胞培养基

♦ Lonza’s 生长因子通常保存在小管子里，成为SingleQuots®.  当 SingleQuot® 管里的组分加到基础培养基里，则称之为 “完全培养基”

♦ BulletKit®:Lonza’s SingleQuots® + basal media =  BulletKit®

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