IP实验知多少~

免疫沉淀（Immunoprecipitation， IP）是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再用ProteinA/G抗体-目的蛋白复合物从混合液中沉淀下来，最后将靶蛋白从磁珠上洗脱，并通过SDS-PAGE，Western Blot等手段对洗脱下来的蛋白进行分析。

3.1 Co-IP实验对照设置

假设Co-IP的实验组为“磁珠+抗X抗体+靶蛋白X+目的蛋白Y”，

则可能出现的“假阳性”及需要设置的阴性对照组如下：

另外，Co-IP实验还需要设置一个阳性对照组（Input组），即直接利用抗体X/Y对细胞裂解液进行WB检测，验证细胞裂解液中蛋白X/Y的存在。

以Hsp70和Apaf-1为例

3.2 Co-IP抗体的选择

选对抗体是我们实验成功的关键所在。在进行Co-IP实验前，我们需要确认抗体可以用于Co-IP实验。因为在Co-IP实验中，抗体需要识别蛋白的构象表位，只能识别线性表位的抗体可能无法将靶蛋白沉淀出来，并不是所有的抗体都可以用于Co-IP实验。所有在选择抗体的时候要选适用于Co-IP的抗体哦。

同时，我们也列出了单抗与多抗的差别。因为单抗相比于多抗具有特异性高，而且不易被干扰，所以优先推荐选用单抗。

另外，还有一点值得注意的是，用于IP的抗体和用于WB的抗体最好是不同种属的，这样可以有效地避免WB检测时重链和轻链的干扰。

悄悄地告诉你，使用以下二抗可以很好地避免干扰哦！

3.3选择合适的抗体使用比例

抗体浓度过低会导致无法检测出抗原，而抗体浓度过高，则就不能沉降在beads上，残存在上清，容易导致高背景。

CST抗体的优势在于，每支抗体的说明书上都会标注好抗体的稀释比例，且是经过经过验证后的最佳使用比例。

3.4 Co-IP琼脂糖珠及磁珠的选择

琼脂糖珠：成本低；

磁珠：方便、背景低，更优。注意：磁珠法需搭配磁力架使用。

小优有多种Beads可以供你选择，琼脂糖珠、磁珠以及大包装随意选。

3.5 Co-IP结果验证

若目的蛋白为已知蛋白：Co-IP/WB。

若目的蛋白为未知蛋白：Co-IP/MS。

实验过程中总是会遇见各种高背景和无信号等问题，下面我们也进行了总结：

最后小编有一款神器推荐给大家，就是我们absin的免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒，简单好用！

 注：Lysis buffer 使用前，立刻加入 1 mM PMSF（推荐购买abs9146，自行配制）

除了普通的一抗之外，标签抗体也是我们常会用到的，CST也有各种好用的标签抗体可以供大家选择。但是使用标签抗体时，大家是不是总会担心标签分子量过大，比如GFP标签，会改变我们的抗体构象，影响后续实验中的抗体识别。在CST科研团队的努力下，新研发出了小片段的标签抗体，妈妈再也不用担心因为分子量过大的问题导致实验没有结果啦。小优也会在后期的交流中给大家详细介绍这一产品，大家别忘了关注哦！