亲和层析大放送

亲和层析是蛋白纯化中最常用的技术。了解蛋白纯化可以从亲和层析开始。

亲和层析是以蛋白与层析基质上特异性的配基具有可逆的相互作用为基础的一种纯化技术。亲和层析具有很高的选择性，可以达到很高的分辨率，而且也可以快速处理大量的样本。因此常常被用来作为蛋白纯化的首选步骤。

亲和层析在样品捕获阶段是一个理想的技术，只要感兴趣的蛋白有合适的配基，就能够使用亲和层析来进行纯化。由于亲和层析具有高选择性，高分辨率和容量，并且对活性物质具有很高的回收率，因此使用亲和层析可以节省大量的纯化时间，使用更少的纯化步骤，使目标蛋白从复杂的生物混合物中纯化出来。

亲和层析中常用术语：

基质：配基结合在基质上，基质应具有理化的惰性。

间隔臂：在配基和基质中间，用于克服可能存在的空间位阻效应，改善配基和目标分子的结合。

配基：能够可逆的结合特定目标分子。

结合：通过优化缓冲液条件，确保目标分子和配基分子能够有效相互作用，保证目标分子能很好的保留在亲和介质上，而其他分子流出层析柱。

洗脱：通过改变缓冲液条件使目标分子和配基间的结合弱化，使目标分子可以离开介质并流出层析柱。

亲和层析主要分为标签蛋白纯化，抗体纯化和其他亲和层析。

常用的标签有His，GST，MBP，Strep(II)等等，每种标签都有自己的特点。Cytiva为重组标签蛋白的纯化提供了多种层析填料。

1、  纯化蛋白的表达

重组蛋白表达第一步首先是要构建重组蛋白表达体系。在选择载体时需要考虑到是适用于原核还是真核的体系，纯化产物的规模，重组蛋白的用途等等。

在进行纯化蛋白的表达之前，选择合适的宿主系统非常的重要。许多系统可以适用于纯化蛋白的表达之中，包括细菌，酵母，植物，真菌，昆虫和哺乳动物细胞等等。每一个宿主细胞都有自己的优势和劣势，所以在构建表达载体之前需要慎重考虑。

在选择宿主系统时，应该考虑到纯化产物的规模和纯度，蛋白的完整性以及潜在的毒性。例如，如果构建的重组蛋白具有翻译后修饰，就不能选择细菌表达体系。

同时，蛋白表达的位置也会影响到蛋白纯化的选择。例如，如果选择细菌宿主，有些蛋白可能会在胞内表达，有些蛋白可能会被分泌到胞外。如果目标蛋白在胞内表达，那么在纯化时需要考虑到要去除大量的杂质蛋白以得到比较纯的目标蛋白。如果目标蛋白被分泌到胞外，杂质蛋白可能会比较少，如果你的培养基中含有EDTA的话，不建议直接上Ni柱的。这是因为EDTA会螯合Ni柱上Ni离子，会在洗脱时把Ni柱上结合的Ni一起洗脱下来。

2、  标签的选择

纯化重组蛋白有很多标签可以选择。最常用的标签是(histine)6组氨酸标签；其他重要的标签还有GST和MBP，都是蛋白质类型的标签；另外还有商业化的标签Strep-tag II。对于这些标签，Cytiva提供了多种类型的纯化产品，例如预装柱，填料，小型离心柱，重力柱，带有标签的磁珠等等，大家可以根据需要来选择不同的产品。