【罗工秘籍3】老板让我用流式的方法检测TH1/2/17，我却一头雾水？

小A：罗工你好，我接了一个课题，检测小鼠脾脏Th亚群的变化，一查文献就懵了，为啥脾脏的Th亚群检测的biomarker，有IFN,IL-4这些炎症因子呢？不是说一般鉴定细胞亚群都一些CD3，CD4开头的表面Marker吗？

罗工：别急，我来告诉你，之所以检测这些炎症因子，是由Th1，Th2，Th17这些Th细胞亚群的特殊性导致的。我们知道Th细胞包含了很多功能性亚群，但是截至目前，这些亚群本身的表面biomarker知之甚少，有些文章中提出一些趋化因子受体CXCR3,CCR4,CCR6是其表面marker，然而这些文章绝大部分都是human的样本。

对于小鼠样本，我们只能退而求其次，从其细胞能特异性分泌某种炎症因子的特点上，来反推这类细胞是什么。比如能分泌IFN-g的细胞我们一般认为其是Th1型细胞，能分泌IL-4的我们认为是Th2型细胞。因此这些炎症因子正是用来作为鉴定区分Th亚群的关键指标，当然有时候我们也会选择更深层的核转录因子，比如Treg的常见指标就是Foxp3这个核转录因子：


小A：哦！我大概明白了，那我就直接检测这些指标就行了？这些炎症和转录因子的流式检测和我之前做的CD3，CD4，CD8的染色有啥不一样的地方吗？

罗工：炎症和转录因子的检测和表面染色很不一样。

小A：啊？不会吧，我就会染些简单的，咋办？

罗工：别急，我来告诉你这些指标怎么染色，保证一看就懂：
首先，不论炎症还是胞内因子都是无法像CD3那样直接加抗体染色的，因为我们常用的荧光流式抗体不具备自主穿透细胞膜的功能，直接加进去只会被细胞膜挡在门外，想要染上他们，需要我们手动给细胞建立抗体进入其内部的通道，即固定/破膜步骤。固定可以让细胞内部的蛋白结构稳定下来，破膜可以让细胞表面产生孔径，方便荧光抗体进入内部染色：


小A：原来是这样，那还好，可以接受，就是麻烦点。但我怎么听师兄师姐说做炎症因子流式特别难，而且做一次实验时间特别长？

罗工：这个确实，炎症因子的流式实验会多出一个步骤，就是体外刺激。IFN,IIL-4这些分泌型细胞因子除了需要固定破膜以外，还需要对细胞前期进行激活和蛋白转运抑制的处理，这样才能保证有足够的细胞因子在胞内累积便于后期检出。

小A：体外刺激，怎么做啊？

罗工：最常见的T细胞刺激剂就是PMA+离子霉素了，这个刺激时间一般在6h左右，除了刺激以外，我们还要加入BFA或者莫能霉素来阻断富集这些因子，这样更有利于后续实验的阳性率。

小A：那这个时间太长了，做完肯定要熬夜了。。。

罗工：额，其实根据我的经验大可不必，我们可以考虑在下午或者晚间处理细胞，将细胞的激活和蛋白转运抑制的时间放在晚上，第二天过来直接收细胞，这样的时间安排就会好很多了。

小A：也就是炎症因子的染色的步骤为提取样本后的刺激阻断—表面染色—固定破膜—胞内染色，如果核转录因子就是提取样本后表面染色—固定破核膜—核内染色。这样思路就清晰多了！

罗工：是的，完整的流程就是这样！