【罗工秘籍6】补偿难于上青天——如何使用flowjo调节补偿

应胡同学的要求，特别出一期补偿调节专辑分为上下两集，分别教学1.如何使用flowjo完成补偿调节；2，如何从自己的实验结果判断补偿是否合适，本期讲解前者。

首先我们要了解什么是流式里的“补偿”。我们知道我们流式中用的荧光抗体，他的特点就是偶联了荧光素的一抗，而荧光素发出的光，科学的说法是波长，是存在一定范围的，例如FITC这个荧光，他的最大发射波长在520nm左右，但是实际上在575nm处也会有激发，也就是说这个荧光的范围很“宽”，这就造成原本一个FITC的荧光，在不做任何干预的情况下PE通道也会有些许信号：

FITC，PE，APC，Percp四种荧光素的em范围，可以看到很多都存在相互干扰覆盖。

单独染色FITC，在不加干预的情况下PE也会有阳性哦！

那么，如何减少这种荧光泄露造成的影响呢？在流式细胞仪上，有一个选项叫做“Compensation”直译过来就是“补偿”，补偿就是人为校正减除掉原本不应该出现的阳性信号，将结果恢复到正常情况下展示，例如上面的FITC，我们通过单染FITC的样本管作为补偿对照管，在仪器上补偿校正后就可以得到无PE信号的结果图啦：

问题来了，有的时候我忘了调补偿，或者我觉得仪器上的补偿调节不太准，我想要在自己的电脑上再调节或者抢救一下，怎么办？下面进入正式教学，还是继续使用flowjo这款软件完成今天的技巧。Flowjo支持2种调节补偿的方式，分别是代入单染管数据拟合补偿矩阵和直接在补偿矩阵中调节2种。

第一种，代入单染管数据拟合补偿矩阵适合保存有单染管的上机文件，并且单染阴性和阳性分群很明显的老师，操作方法如下：

将单染的数据（一定要包含空白管，并且最好单染以单染管的荧光通道来命名）拖入compensation中：

代入后点击主界面像彩虹桥一样的选项，即可进入补偿计算界面，在拟合好阳性群后点击apply to group即可应用：

第二种，直接建立补偿矩阵，在补偿矩阵里微调补偿，适合对补偿比较熟悉，对数据分析要求比较高的老师：

我们找到样本前面的正方形（上机时有补偿记录的有九宫格，没有调过补偿的就是空心正方形），双击打开补偿矩阵。

如果没有调过补偿的需要新建补偿矩阵，操作如下图：

在补偿矩阵中进行相应的补偿调节：

这是我们第一种调补偿的方法，大家有GET到嘛？等到熟练后罗工将教大家第二种方法，敬请期待吧！有任何不懂的，也欢迎给我留言哦！