【罗工秘籍13】样本准备好了，抗体却用完了？罗工来告诉你怎么办

样本已经准备好了，抗体却用完了？罗工来告诉你怎么办。

 

“罗工，最近买了一批抗体，有一两只还没到，可是我的老鼠已经快挂了，咋办啊。。”

“罗工，听说现在国外圣诞节+疫情，挺多抗体发货要6-8周了，真的假的？那我收的样本咋办？”

 

说实话，最近一段时间每周都会有老师过来询问这个问题，相信大家也会时常碰到要做实验了结果移液枪一吸，发现某个抗体早已用完了的情况，这时候样本已经准备好了，我们要怎么办呢，流式的样本是否有适合长期保存的方法呢？

 

当然有，今天罗工就来给大家吃一颗定心丸，如果我们的样本是从外周血，组织中处理出来的单个细胞悬液，我们可以提取其中的PBMC进行细胞冻存处理，并在合适的时候再复苏，这样一来，就可以达到长期保存样本的目的了。

 

对待测PBMC进行冻存复苏处理，从方法上有2中方法给大家参考，方法1适合后续要进行功能实验的样本，或者是仅进行表面染色分型的样本，方法2适合胞内因子染色的样本，对胞内因子的检测准确性更有保障：

 

方法1，直接对新鲜PBMC进行冻存，待将要检测/处理时再进行复苏，冻存PBMC的关键在于恒定速度来降低温度至负80度。

方法如下：

1、预先配置20%的DMSO，4度预冷，包括即将使用的冻存管；

2、收获PBMC细胞，纯血清重悬（一定要纯血清，别心疼）PBMC。细胞浓度最好是2×107；

3、逐滴加入等体积20%的DMSO，混匀；

4、将冻存管放于塑料泡沫盒中（装15ml离心管的那种），外面用保鲜袋扎紧，放于-80度冰箱中，过夜。而后转移至液氮中冻存即可。

 

当我们后续要开始进行实验和染色时，再进行如下复苏步骤：

1、取出冻存管，37度水浴解冻；

2、用移液管将将冻存管中的细胞转移至15ml离心管中；

3、逐滴加入5倍于冻存液体积的培养液（预先平衡好），边加边混匀，这一步主要是为防止PBMC的渗透压变化太大，导致细胞破裂或损伤；

4、再加入5倍体积的培养液，混匀，离心；

5、重悬细胞后，再加入10ml培养基洗涤一次；

6、关键步骤：将细胞放置于37度培养箱中 室温平衡0.5-1h，再进行后续的染色实验（这一步很重要，刚复苏的细胞上的一些MHC表型会存在显著差异，但是只要37度复温0.5h后，表型就会显著恢复正常。）

 

方法2，将新鲜的PBMC进行预处理，例如必要的刺激阻断，或是直接进行手上已经有的表面抗体的染色，然后进行如下步骤：

a. 细胞固定与保存

1.） 100μl 4%多聚甲醛（或 1 ml/10^7 细胞） 重悬细胞， 4°C 孵育 10-20 分钟；

2.） Staining Buffer 清洗细胞 2 次；

3.） Staining Buffer 重悬细胞，用 90% FCS/10% DMSO 重悬细胞，-80°C 长久保存。

 

b.对已固定的细胞进行破膜

1.）对于冻存细胞，清洗 2 次去除 DMSO；

2.）将细胞重悬于PBS，如果要进行胞膜内染色，则重悬于Perm/Wash™ buffer ，孵育 15 分钟；

3.）离心去上清；

4.）进行后续的流式染色步骤即可。

 

不论是使用方法1还是方法2，都可以达到我们长期保存细胞样本的目的，方便我们对样本进行批处理检测，或者是有时抗体没到时的等待；两者都有足够的文献支持:

血和单核细胞的固定和冷冻保存:不同操作方法对流式细胞术淋巴细胞亚群分析的影响

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15624203/

尽管某些免疫表型细胞在冻存之后绝对计数减少，但是与新鲜血液之间具有良好的相关性（除了噬碱性粒细胞）：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=28378896

在新鲜样本冻存复苏后细胞表型无显著差异，但部分细胞因子表达受到影响：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12957398/