【罗工秘籍18】为什么你的组织样本制备老是出问题

本期罗工秘笈我继续接着给大家介绍分享一些复杂类样本的流式样本制备，那就是如何有效的获取组织中的免疫细胞，希望对大家有所帮助：）


在处理样本前，我们首先来了解一下组织样本的一些特点。

首先，不同于血液/骨髓中的细胞，组织之间的细胞因为各类胶原蛋白易粘连在一起；

其次，组织样本中免疫细胞占比很少，有大量组织细胞干扰，并且部分组织细胞自带荧光；

然后，组织样本放置时间长后组织会自溶，影响检测结果；

所以为了确保组织样本的流式实验的顺利完成，我们要做好样本的前期处理，从样本收集开始就要注意。

 

组织样本的收集：

取材：取材后应低温保存，一般浸泡于1640培养基或者是pbs中；

有条件浸泡于组织保存液之中，我们常用的就是美天旎的组织保存液130-100-008，它可以在4℃保存新鲜样本48小时不变质，降低样本背景效应，避免细胞激活或凋亡诱发，保持细胞活性和功能，对那些来不及处理的组织样本的短期保存非常有利；

接下来是要把组织样本制备成单细胞悬液，主要通过机械法和酶消化法或两种方法结合处理。

机械剪碎：2-4mm碎块

酶消化：是关键的步骤，主要目的是为了破坏组织间的胶原，水解细胞间紧密链接的蛋白，水解粘多糖；选择正确的酶也是样本处理成功的关键。

 

如何选择正确的酶类型呢？这里推荐两种途径：

1.自己配酶：查阅文献或资料来选择合适的酶配制解离液，这里推荐使用优宁维worthington的网站工具：https://www.univ-bio.com/worthington.html，不同的组织有推荐适用的酶且附有相应的参考文献。

2. 直接购买成品kit：美天旎组织解离试剂盒，例如针对比较难处理的小鼠肿瘤样本，130-096-730 Tumor Dissociation Kit, mouse，适用于多种类型的实体瘤，解离得到的细胞活性和表位都保留完好，免疫细胞获得率也更高；这种方式节省了大家摸索酶配制和解离条件的时间。

如果大家选择自己搭配酶来消化的话，这里也给大家整理了一些常规消化步骤：

1. 将组织放置于EP管内，剪碎，加入1ml有酶的培养基（例如：Collagen 和 DNA 的混合酶，均为10ul/ml），37度四十分钟；

2. 用金属筛网磨瘤子，过尼龙筛网(200目)，15ml离心管1500rpm五分钟即可

 

 

如果选美天旎肿瘤组织解离试剂盒可以配套Gentle仪器自动化处理；操作视频页面链接：https://www.miltenyibiotec.com/CN-en/products/tumor-dissociation-kit-mouse.html#nonExistingAnchor

 

 

处理好组织样本后，是直接用单细胞悬液染色上流式分析还是继续使用梯度密度离心法提取PBMC后染色上流式分析？

这取决于你的实验目的：

想要观察免疫细胞在组织样本中的占比时，单纯表面染色时，推荐直接用单细胞悬液上机；

需要严格界定细胞数的实验，例如胞内炎症因子染色，核转录因子染色，推荐用梯度密度离心法提取PBMC后上机。