L-4小时就可检测磷酸化蛋白和总蛋白？

       PerkinElmer拥有多种基于细胞的实验产品线，可用于不同的研究，如磷酸化蛋白检测。其中包括特定磷酸化蛋白和总蛋白的测定。结合特异性磷酸化蛋白的测定及其相关的总蛋白测定，可以帮助研究人员准确识别调节磷酸化的候选分子，以及通过正确的实验数据分析来表征其作用机制。

       如果不同时评估磷酸化蛋白以及总蛋白水平，研究人员可能会得出错误的结论：认为某种化合物可以上调或下调磷酸化水平，而实际上这种作用可能是由于该蛋白表达水平的变化造成的。从而造成结果的错误解读。

        本篇文章基于PerkinELmer的HTRF技术，目的是提供有价值的指导方针，用以有效分析和解释由磷酸化蛋白和总蛋白实验相结合而获得的结果。以AKT和MEK的磷酸化为例，通过遵循这些实验准则，研究人员可以期望获得最可靠的结果，同时从样本中得到更多信息，包括获得化合物的基本作用机制（MOA）。

• 本研究进行了total akt和phospho- akt Ser473以及total MEK和phospho MEK1Ser218/222等4项实验。
• Total实验检测相关蛋白的总水平，包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白，并与特异性磷酸化蛋白检测实验结合，以监测蛋白表达水平变化与蛋白磷酸化变化之间的关系。
• 所有实验均采用贴壁细胞，选取标准双板HTRF检测方法进行。总的来说：于96孔板中将细胞与化合物混合进行孵育，随后将细胞裂解，再转移至两个不同的实验板上，一个测量phospho-AKT，另一个测量total-AKT，并添加适当的HTRF试剂进行检测。
• 在100,000细胞/孔（HEK293）的密度下进行所有AKT实验。一组使用AKT激活剂—胰岛素样生长因子1 (IGF-1)，于不同浓度下孵育细胞10分钟；另一组使用蛋白质合成抑制剂—环己酰亚胺，孵育细胞16小时。
• 在100,000细胞/孔（Hela cell）的密度下进行所有MEK1实验。使用MEK1激活剂—表皮生长因子(EGF)，于不同浓度下孵育细胞5分钟。

 

Fig.1 Standard two-plate assay protcol

实验优化

        特异性磷酸化蛋白和总蛋白检测都需要进行优化以确定最佳的实验条件。如每孔的细胞数，以确保两种实验都在检测的线性范围内，并具有合适的检测条件即S/B>3。

数据处理

         磷酸化和总蛋白数据的评估需要计算HTRF Ratio值。每孔的HTRF比率值独立计算，这些值会用于后续的统计分析，如确定平均值或平均值的标准误差。

HTRF Ration值采用下列公式进行计算：

       采用下面的公式计算磷酸化蛋白和总蛋白的归一化值。归一化值属于一个相对值，代表磷酸化蛋白与样品中存在的总蛋白的比例。公式如下：

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数据归一化分析

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• 用已知的AKT磷酸化激活剂(IGF-1)和蛋白质合成抑制剂处理细胞(环己酰亚胺)。进行Phospho-AKT和total-AKT测定。数据以HTRF比率和归一化值表示(图2和图3)。
• 正如预期的那样，用IGF-1处理细胞(图2) 呈剂量依赖性增加AKT 473丝氨酸磷酸化水平，其EC50值为1.06 nM。IGF-1也能下调AKT表达，IC50值为0.8 nM。使用两种实验的数据计算的P-AKT/T-AKT归一化值表明，在IGF-1刺激下磷酸化AKT与非磷酸化AKT的比例显著增加。
• 环己酰亚胺处理(图3)导致AKT磷酸化降低，AKT表达降低，IC50值相似。如果没有进行total AKT测定，只评估了磷酸化AKT测定结果，那么环己酰亚胺可能被错误地识别为AKT磷酸化抑制剂。
• 将两种实验的数据归一化后，可以清楚的看出环己酰亚胺没有对AKT磷酸化水平进行调节(图3)。因此，环己酰亚胺为AKT表达的抑制剂，IC50值为460 nM，但它并不抑制磷酸化。

Fig.2 Compound modulation of AKT phosphorylation and AKT expression

Fig.3 Compound modulating only AKT expression

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归一化值如何正确识别化合物的MOA

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• 归一化值是一个相对的值，它结合了两个独立的生物细胞事件的结果，并且可以对结果进行调节。因此，必须结合评估三组数据—total-AKT HTRF比率，phospho-AKT HTRF比率和归一化值，以正确识别化合物的MOA。为了说明这一前提，将图4所示的IGF-1刺激AKT磷酸化的数据与用EGF刺激细胞时的MEK1实验结果进行比较(图5)。
• 如前所述，IGF-1刺激细胞可以正向调节AKT的归一化值(图4)。在EGF刺激细胞后，MEK1归一化值也被正向调节(图5)。由此，我们是否可以得出结论，它们作用机制是相似的?事实上，这样的结论是不正确的。
• 结合所有实验数据表明，尽管EGF和IGF-1有相似的表现，但它们的MOAs是不一样的。IGF-1刺激细胞可积极调节AKT磷酸化并调控AKT负表达，而EGF刺激只诱导正向调节MEK1磷酸化。这说明，需要结合评估特异性磷酸化蛋白和总蛋白检测的实验数据，才能够得出最准确的结论。

Fig.4 Compound modulation of AKT phosphorylation and AKT expression

Fig.5 Effects of growth factor stimulation on AKT phosphorylation

 

结论

        结合特异性磷酸化蛋白和总蛋白实验，正确地分析和解释数据，可以使研究人员准确地识别调节特定蛋白磷酸化的化合物，并阐明其作用机制。这些结果说明了特异性磷酸化蛋白和总蛋白实验数据进行并排评估以及汇编这两种实验的数据以表示归一化值的重要性。这种渐进的实验分析方法确保了化合物命中识别的准确性，并提供了对MOA深入了解的途径。

 

 

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BCR pathway	Cell Cyde/DNA Damage	JAK/JAK2/STAT Pathway JAK2	MAPK Pathway	NFκB/TBK1 Pathway	PI3K/Akt/mTOR Pathway	Receptors	TGFß/BMP/SMAD Pathway	TCR pathway	Other	Other
PLC G2	CDK2	c-Myc	ATF-1	IKKa	4E-BP1	ALK	c-Myc	ZAP70	Acetyl CoA	Rb
	CDK4	STAT1	ATF-2	IRAK4	Akt 1/2/3	c-Met	SMAD1	SLP-76	carboxylase	IKKB
	Chk1	STAT3	c-Myc	MLKL	BAD	c-Myc	SMAD2	PLC G1	Alpha-Synuclein	RSK1
	Chk2	STAT4	ERK 1/2	NFkB	c-Myc	EGF Receptor	SMAD3		AMPKα1/2	4EBP1
	H2AX	STAT5	IRAK4	PKC	eIF4E	ErbB2			Beta catenin
	HDAC4	STAT6	JNK1/2/3	RIPK1	GSK-3ß	FGF Receptor 1			BTK
	KAP1		MEK1	TBK1	mTOR	FGF Receptor 2			CREB
	P53		P38 MAPK		p70S6K	FGF Receptor 3			Cofilin
	Rb		Raf1		PDGF	FGF Receptor 4			DAP12
	CDK6		RSK1		PI3 kinase	IGF-1 Receptor ß			EIF2α
					RPS6	Insulin Receptor ß			GAPDH
					S6RP	RET			Lck
					SHP-1	TrkA/B			LRRK2
					SHP-2	VEGF Receptor 2			PD-1
									STING
									SYK

 

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