CFSE细胞增殖操作Protocol

细胞增殖的流式检测 (CFSE )

 

荧光染料 CFSE， 也可称为 CFDA SE（5，6- carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester） 即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得 CFSE 成为一种良好的细胞标记物。

当 CFSE 以含有两个乙酸基团和一个 succinimidyl ester 功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的 CFSE 分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester 基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。

因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白 被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一 半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。 这种现象可以在 488nm 的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细 胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。 

一 实验所需材料

 

二 CFSE保存温度和溶解

保存：到货后避光保存在-20C条件下。DMSO溶解后，避光保存在-20C条件下，建议在3个月内使用完毕。

溶解：在其中一管CFSE中加入90ul的DMSO，最终浓度是10 mM ，于- 20 ℃避光保存，避免反复冻融

 

 

三 CFSE激发和发射波长

 

最大激发波长	490nm
最大发射波长	520nm

1. 将冰冻过的10mM CFSE恢复至室温使用。

2. 将细胞转移到15或50ml的离心管中。

3. 用1× DPBS清洗细胞，去除残留的血清蛋白。

4. 重复步骤3。

5. 将细胞重悬至浓度为10-30 × 10^6 cells/mL的1× DPBS单细胞悬液中。

注意:避免在叠氮化物、血清或含蛋白质的缓冲液中染色，因为这些成分会与染料结合，可能会干扰细胞的染色。

6. 在单细胞悬液中加入CFSE溶液，最终浓度为1-10 μM。如有必要，可以在加入单细胞悬液之前用DMSO进一步稀释。漩涡。

7. 在37°C水浴锅中孵育10-15分钟。

8. 离心后加入9×原体积的1× DPBS。

9. 去除细胞上清

10. 加入10 mL含10%胎牛血清的完全培养基，重复离心步骤

11. 去除细胞上清

12. 在完全培养基中重悬细胞，通过流式细胞术进行细胞培养或分析

 

注：

1. 设置对照实验，需要同时做：样本细胞被 CFSE 标记且刺激的，即实验组；CFSE 标记但不刺激的，用来比较有无刺激细胞的增殖状况；未标记且刺激的和 未标记但不刺激的，用来确定样本细胞的荧光本底值，确定阳性范围;

2. CFSE染色时，加入CFSE染料一定要均匀,确保每个细胞标记 CFSE 的强度一致；

3. 尽量使用原代细胞完成实验，传代久的细胞再次刺激分裂能力较弱，CFSE 标记后出现递减荧光强度峰的数量会减少；

4. 当细胞数量少时，用 2% FBS/PBS 重悬细胞，并降低 CFSE 工作浓度，缩短标记时间，可以减少 CFSE 对细胞的损伤，保持细胞分裂能力；

5. 若对刚标记完的细胞进行流式检测，会发现 CFSE 的荧光强度很高但不稳定，18 h后会恢复到稳定的荧光强度；