1.封闭

利用惰性蛋白。非离子去污剂，或无蛋白的封闭剂来封闭膜上未被占据的位点，从而减少抗体的非特异性结合。封闭剂与膜的亲和力应高于抗体，并且不会替换膜上的目的蛋白。

通常有两种常用的封闭剂，牛血清白蛋白（BSA）和脱脂牛奶。以下我们简述了这两种封闭剂使用的各自特点和i 注意事项，帮助选择更适用于您实验本身的封闭剂。

封闭产品推荐

2.抗体孵育原理

目的蛋白印迹在膜上，经过封闭之后，印迹目的蛋白与一个或多个抗体孵育。第一个抗体（一抗）与目的蛋白结合，而第二个抗体（二抗）与第一个抗体结合，二抗本身结合有酶或染料，可用来指示蛋白的位置。不过有些一抗也具有直接标记的功能，但使用标记二抗有明显优势。首先不止一个二抗分子能与单个一抗分子结合，形成信号；其次，标记的二抗可用于大量不同特异性的一抗，因而无需标记多个一抗。

3.抗体的选择

在对于任何一种目的蛋白，都有不止一种有效抗体。为缩小选择的范围，我们通常要考虑以下几个方面：

①分析或应用类型
主要参考厂家提供的抗体数据表。有时，未说明的用途没有列出，仅表示抗体未检测是否具有该用途或不知道抗体如何发挥作用。

②样品的性质
对于样品的性质，我们至少要考虑以下两方面：
a.要检测的蛋白区域。如果要检测的是一个蛋白片段或全长蛋白的异构体或特定区域，那就要求选择的抗体是由该特异片段等的免疫原刺激产生的。
b.样品的处理工艺。有些抗体仅识别降解或变性蛋白，有些抗体仅识别天然蛋白抗原表位，因此要根据实验样品处理的具体情况选择抗体的使用。

③抗体的种类
多克隆一抗和单克隆一抗都可以使用，但要注意，变性蛋白可能无法被天然抗原制备的抗体所识别。一般来说，用标记二抗来检测非标记一抗时，产生一抗的宿主动物的类别也是不同的。在进行WB的细胞裂解液被认为不含有IgG；而组织溶解液和组织培养上清（含血清）被认为含IgG。在进行WB实验时，IgG会以50和25kDa的条带出现在降解和变性样品中，分别相当于IgG的重链和轻链。 在二抗种类的选择上，二抗应来源于产生一抗的物种。

④抗体的标记和检测
标签结合在抗体上使抗体的结合可见，选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗，不建议使用碱性磷酸酶（AP）标记二抗，因其不够灵敏。

4.抗体的稀释使用

所使用的稀释溶剂可选择含有低浓度封闭剂的TBST或不含有封闭剂的TBST，含有封闭剂的TBST稀释抗体，在孵育过程中可以相应减少非特异性吸附，避免背景过高的现象。抗体稀释溶剂TBST中一般都含有0.1%的吐温-20去污，可防止抗体的非特异性聚集，但要知道，吐温-20浓度高于0.05%（v/v）时，就有可能从膜上洗掉一些印迹蛋白。

按照抗体说明书建议的稀释倍数进行稀释使用，有时一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。一般来说，高倍稀释一抗可减少非特异性信号，高倍稀释酶标二抗可最大限度降低整体的高背景。

5.抗体孵育时间和温度

一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过18h）不等具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度。一般建议使用较高的抗体稀释倍数结合较长的时间孵育，以保证特异性结合。若孵育时间较长应在4℃进行。

二抗孵育在一抗结束后，TBST洗膜5min以去除残留一抗。孵育一般在室温下1-2h。

抗体及相关产品推荐

6.清洗

清洗转印膜可从膜上去除未结合的抗体或多余封闭剂，它们会导致高背景和检测不佳。常用清洗缓冲液是含有吐温-20的PBS或TBS稀释液。如前所述，高浓度的去污剂可能会使目的蛋白从膜上洗脱。而对于高度纯化抗体，往往使用不含去污剂的缓冲液进行清洗。

清洗次数和时间根据具体实验来确定，清洗过少会产生过高背景；过度清洗会洗脱目的蛋白或降低信号。建议清洗3-5次，每次5min。

在TBS清洗液中添加最多0.5M的NaCl和0.2%的SDS，并将清洗延长至2h，可降低顽固背景。

清洗相关产品推荐