免疫沉淀与分子间相互作用

生物体内蛋白质控制着细胞中的所有生物系统，虽然许多蛋白质是独立执行它们的功能，但是绝大多数蛋白质会与其他蛋白质相互作用，从而发挥其生物活性。因此，对于蛋白质相互作用的研究也是生物研究的重要环节。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是研究蛋白质相互作用的经典技术，被广泛应用于各研究领域中。Co-IP与单个蛋白的免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)基本原理相同，都是利用抗原与抗体之间的特异性结合，并同时与该抗原分子特异性结合的其他分子一起沉淀的富集技术。对于免疫沉淀（IP）来说，通常对沉淀下的目标抗原蛋白X进行定性或定量的分析。而免疫共沉淀（CO-IP），即是将与X蛋白相互作用的Y蛋白共同沉淀下来，以研究两个蛋白之间的相互作用。（如下图所示）

IP/Co-IP: IP实验主要用于目的蛋白的纯化和富集，是在组织或细胞裂解液中，加入识别目的蛋白X的特异性抗体（单克隆或多克隆抗体），孵育后再加入可以特异性亲和结合免疫球蛋白的偶联于sephorose beads上的Protein A/G（也可以是特异性识别抗体的二抗），于特定条件下孵育后形成Protein A/G beads + Anti-X抗体 + 抗原蛋白X的复合物，再通过离心完成对目的蛋白X的富集。利用类似的原理，复合体可以将与蛋白X有相互作用的蛋白Y一起富集下来，这种方法被叫做Co-IP，后续可以通过免疫印迹或蛋白质谱检测免疫沉淀复合物，来研究X与Y之间的相互作用。

IP/Co-IP原理示意图

利用Co-IP技术，可以证明两个蛋白质在胞内存在相互作用，但是这个作用可以是直接地相互作用，也可以是通过第三个蛋白，形成复合物后的间接相互作用。并且，免疫沉淀原理很依赖寻找合适的靶蛋白特异性抗体，有些蛋白无法找到可用的抗体，从而无法进行免疫沉淀实验。对于验证两个蛋白之间是否为直接相互作用关系，亦或是目的蛋白没有适合进行IP实验的抗体，我们还可以进行Pull down实验来进行分析。

Pull down实验中，无需通过特异性抗体捕获抗原蛋白，而是带有标签的融合诱饵蛋白被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获，二者结合后的复合物与猎物蛋白样品孵育，若蛋白之间存在相互作用关系，那么猎物蛋白就会结合到复合物上，从而检测蛋白质之间相互作用。

Pull down assay

利用免疫沉淀原理，不仅可以研究蛋白质之间的相互作用，也可研究蛋白质与核酸之间的相互作用。如研究体内基因组DNA与蛋白质之间相互作用的染色质免疫沉淀（ChIP），和研究细胞内RNA与蛋白结合情况的RNA结合蛋白免疫沉淀技术（RIP）。

染色质免疫沉淀（ChIP）

是研究基因组DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它的基本原理是在生理状态下把细胞内有相互作用的蛋白质和基因组DNA交联在一起，超声波将其打碎为一定长度的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段进行测序或PCR等检测，来分析目的蛋白可以与哪些基因组DNA相互作用。

RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）

RIP与ChIP相似，除了RNA结合蛋白被免疫沉淀而非DNA结合蛋白。随后，通过RT-PCR和cDNA测序对免疫沉淀所得的RNA进行分析鉴定。