IP/Co-IP实验流程

▶样品准备

IP/Co-IP样品蛋白主要分为以下几种：细胞内源性表达蛋白、细胞内过表达蛋白和组织内蛋白的免疫共沉淀。一般对样品的要求较高，以新鲜的蛋白样品为佳。根据细胞系或被捕获的抗原后续用途的不同来选择合适的细胞裂解条件。 对于没有细胞壁结构的哺乳动物细胞，可以直接使用去污剂进行裂解，但其它细胞，则需要一些机械剪切力辅助，例如超声破碎等。

IP/Co-IP样品制备

▶珠子准备

利用Protein A和Protein G对抗体的特异性亲和作用将抗体捕获，从抗体捕获角度来看，Protein A Sepharose和Protein G Sepharose在免疫沉淀的应用非常关键，其各自也有不同特点，根据实际情况进行选择优化。

Protein A：是金黄色葡萄球菌的表面蛋白，有5个不同的结合位点对IgG的Fc片段具有很强的特异性亲和力，一个Protein A分子至少可结合2个IgG分子，同时也可能会有IgM/IgA/IgE结合在Protein A上。

Protein G：Protein G是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，可与IgG Fc区域特异性结合，还可以特异性低亲和的与Fab区域结合，并且重组的Protein G已经除去了与白蛋白的结合位点，减少了非特异性结合。相较于Protein A，Protein G可以更加广泛、强效地结合更多类型IgG。

Protein A/G

Protein A与Protein G的选择，要结合不同来源的抗体，具有有物种和亚型的选择性。一般推荐鼠源抗体使用Protein G，兔源抗体使用Protein A。并且可以将Protein A与Protein G等比混合以达到匹配更多不同种属来源及亚型IgG的效果。

▶抗体准备

抗体捕获填料，通过抗原抗体的特异性结合，使抗原蛋白免疫沉淀。在IP/Co-IP实验中，抗体起到至关重要的作用，在选择抗体时要结合实际的实验情况。

◆多克隆抗体和单克隆抗体

多克隆血清抗体能和抗原的不同表位匹配，有助于抗原-抗体-Protein A/ G填料这个复合体的稳定，但在检测时可能会使得背景变深。并且多克隆抗体中可能还有能结合其它抗原的抗体，需要使用亲和层析方法对抗体进行纯化。

◆抗体重链和轻链

为避免抗体重链轻链被识别，在免疫沉淀抗体捕获填料阶段，和后续WB检测阶段，尽量选择不同种属来源的抗体。如抗体种属有限，没有其他种属来源的抗体，在WB检测时，可选用非识别IgG重链或轻链的二抗，以达到理想实验结果。

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IP/Co-IP抗体选择

IP/Co-IP辅助试剂

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▶免疫沉淀实验

在保证蛋白样品质量，并正确选择抗体与填料（Protein A/G Sepharose）后，即可开始进行免疫沉淀实验。首先需要利用抗体与填料的结合，将靶蛋白免疫沉淀下来。在这一步骤中，可先将抗体与靶蛋白孵育结合后，再与填料孵育将抗体-靶蛋白复合物免疫沉淀；有时抗体与Protein A/G Sepharose亲和力不高时，可先让抗体与其beads孵育，再捕获目的蛋白，并使用交联剂将抗体交联在Protein A/G Sepharose上，使抗体不易被洗脱。在清洗过程时可加入低浓度的非离子型去污剂，以降低非特异性吸附。

靶蛋白-抗体复合物在低温环境下被填料免疫沉淀后，形成靶蛋白-抗体-填料复合物，使该复合物与被检测蛋白样品于低温环境下进行孵育结合一定时间，最终通过WB检测，验证蛋白质之间的相互作用。

▶Pull down研究蛋白质相互作用

进行Pull down实验，首先将需要纯化的带有标签（GST-tag/His-tag）的重组蛋白，用特异结合标签的固相化亲和配基捕获固定，再利用固定在配基上的标签蛋白亲和吸附需研究的目的蛋白，从而研究蛋白质之间的相互作用关系。

标签蛋白填料