ChIP实验概述

染色质免疫沉淀（ChIP）被用于检测细胞核天然染色质结构内的蛋白质与DNA之间的相互作用。传统的ChIP实验首先需要将细胞固定，这使得蛋白质与DNA相互作用交联固定到位。然后利用酶或者超声的方法将染色质打断为片段，使用抗体对感兴趣的蛋白质以及与其结合的DNA进行免疫沉淀。最后解交联，对沉淀DNA进行纯化。纯化的DNA可进行进一步分析，如标准或定量PCR或测序。

这些实验对染色质的完整性、抗原表位的稳定性以及免疫沉淀抗体的特异性较为敏感。这些变量在所研究的蛋白质与DNA相互作用具有较低的丰度和稳定性时变得更为关键。

 

ChIP实验可以主要包括以下几个步骤：

交联固定→染色质剪切→免疫沉淀→DNA纯化→DNA检测

 

（1）交联固定

一般采用1% formaldehyde（甲醛）室温交联10-30分钟，交联的目的是为了建立蛋白质/DNA之间的稳定共价连接，这个过程要注意一下几点。（1）一定要使用新鲜甲醛溶液，因为甲醛容易被氧化，导致交联不充分，在后续染色质剪切的时候则容易破坏蛋白和DNA的共价连接。（2）交联的时间10-30分钟，如果研究对象为转录因子等丰度比较高，和DNA结合也很稳定，交联10min即可，如果研究对象为转录辅因子等丰度比较低，也不是直接与DNA结合，则适当延长交联时间至30min。

 

（2）染色质剪切

根据染色质剪切方式的不同，目前市面上提供两种试剂盒，酶解法和超声法的试剂盒。

酶解法则是在交联处理之后，加入适量的核酸酶特异性的切割核小体，将核小体切割成以1个、2个……核小体为单位的片段。到这里，有些小伙伴可能就摩拳擦掌准备接下来的免疫沉淀了，但是小优提醒您，酶解之后，样品并没有完全切割好，还需要经过短暂的超声处理，把细胞膜和核膜充分打碎，使染色质片段完全释放出来。

如果是超声法，则比较简单了，调整到合适的超声功率，将样品超声处理适当的时间就好了。在这个过程中要摸索好超声的条件，过度超声有可能破坏染色质完整性，会给ChIP实验富集带来负面影响，尤其是转录因子和辅因子。

到这里您可能会想，既然酶解和超声法都有超声处理，那为什么不直接选择超声法呢？这里要跟各位小伙伴强调一下了，酶解法后期的超声时间相对较短，20-30S的超声时间即可，所以相对而言比较好控制实验条件，对于没有做过ChIP实验的老师而言，也比较好操作了。超声法因为对超声的功率和时间要求较高，适用于实验室条件比较成熟的老师。

 

（3）免疫沉淀

向样品中加入抗体将目的蛋白和连接的DNA拉下来。这个过程中引入protein G微珠，将目的蛋白和与它结合的DNA拉下来，这个过程中或多或少也会把其他杂蛋白一起拉下来，所以接下来进行高盐和低盐的洗脱，去掉杂质。

在这个过程中选择合适的抗体对实验结果至关重要。如果您需要做测序，则要选择ChIP-seq级的抗体，如果只是做PCR，选择ChIP级抗体即可。因为ChIP级抗体除了要结合完全裸露的靶蛋白之外，还要结合因构象变化被DNA遮蔽的抗原表位，而ChIP-seq则需要检测全基因组上大量的成千上万的基因位点。所以要严格选择相应级别的抗体。

 

（4）DNA纯化

用蛋白酶K解交联，消化染色质的蛋白质组分和DNA之间的连接，然后经过DNA纯化柱对样品进行纯化。

 

（5）DNA检测

纯化好的DNA进行PCR或者测序分析。

 

CST提供的ChIP试剂盒有以下5款，您可以根据样品和实验的需求进行选择：

 

 

除了这5款ChIP试剂盒之外，小优还给大家提供一个新技术的产品，CUT&RUN Assay Kit #86652S，这是一个利用核酸酶靶向切割和释放研发出来的产品，如果您对这款产品也比较感兴趣的话，可以点击以下网址：

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