细胞死亡&细胞功能：【细胞周期&细胞增殖概述】

细胞周期&细胞增殖概述

细胞增殖是指细胞分裂（细胞质分裂）引起的细胞数量增加，是细胞周期的最后一步。细胞增殖在生命周期中正常组织发育和维持是必须的。

细胞增殖是一个严格调控的过程，许多不同的蛋白质控制着细胞周期检查点。在癌细胞中发现的基因突变会导致不受控制的细胞增殖。

如何测量细胞增殖 

细胞周期由多个阶段组成，包括细胞大小增加的 G1 期、新合成 DNA 的 S 期、细胞进一步生 长的 G2 期，最后是细胞最终分裂的 M 期或有丝分裂期。一些细胞退出细胞周期并停止分 裂;这称为静止或静息状态 (G0)
细胞周期各阶段:G1 - 大小增加;S - DNA 合成和复制;G2 - 生长;M - 有丝分裂和细胞分 裂;G0 - 休眠期。 

测定法	测量内容
BrdU Cell  Proliferation Assay Kit	测量细胞增殖期间发生的 DNA 合成水平
细胞增殖指示剂试剂盒	通过流式细胞仪使用胺反应性染料和染料稀释原理测量细胞分裂，以追踪多轮细胞增殖
碘化丙啶7-AAD	基于其 DNA 的特征量化细胞周期不同阶段的细胞数。

增殖标记物	增殖标记物描述
增殖细胞核抗原 (PNCA)	在 DNA 复制中起重要作用的滑动 DNA 夹蛋白
Ki-67	仅在增殖细胞中高水平表达的非核组蛋白
磷酸化组蛋白 H3	在增殖细胞中磷酸化的核组蛋白
β-半乳糖苷酶活性	β-半乳糖苷酶活性与不增殖的衰老细胞有关

1   MTT原理：

 

MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的实验方法。由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此常常用来检测细胞的增殖情况。

   MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。

产品订购信息：

货号	产品名称	包装规格
4890-025-K	MTT Cell Proliferation/Viability Assay	2500tests
K299-1000	MTT Cell Proliferation Assay Kit (Colorimetric)	1000tests

2  CCK-8

Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

产品订购信息：

货号	产品名称	包装规格
abs50003	Cell Counting Kit-8	500tests/1000tests

3   ATP浓度检测

ATP浓度监测可指示细胞损伤、细胞增殖以及细胞增殖抑制效果的良好指标，且比传统方法更为方便和精确。

    ATPlite™ 1step检测系统利用萤火虫萤光素酶检测ATP，进而检测哺乳动物细胞的细胞增殖和细胞毒性。活细胞生成的ATP与萤光素酶和萤光素反应，促使发光。通过检测细胞中的ATP量的变化，可评估细胞数量的增减情况。

产品订购信息：

产品	货号	包装规格
ATPlite 1step	6016736	10ML
	6016731	100ML
	6016739	1000ML
Human Ki-67 kit	64KI67PEG	500t
	64KI67PEH	1000t

4  BrdU

BrdU是DNA前体胸腺BrdU是胸腺嘧啶T的类似物，在培养细胞过程中在培养基中加入BrdU，BrdU在合成DNA过程中会随机插入到DNA中，之后对细胞固定破膜，用DNA酶处理之后，用BrdU的抗体进行染色，即可得到细胞增殖的结果。

产品订购信息：

产品	货号	规格
FITC BrdU Flow Kit	559619 ▲	50tests
APC BrdU Flow Kit	552598 ▲	50tests

 

5  VPD450/CFSE

CFSE或VPD450是细胞增殖染料，细胞质会与染料结合，分裂一代之后胞浆内染料浓度减半，再次分裂，胞浆内染料浓度降低为原来的四分之一。随着分裂代数的增加，染料浓度逐渐降低，荧光强度降低。

 

细胞增殖-CFSE方法操作Protocol 

产品订购信息：

货号	产品名称	包装规格
562158	Violet Proliferation Dye 450	1.0mg
565082	CFSE	1.0mg
abs9106	CFSE	10mg/50mg

案例使用VPD450研究细胞增殖与IL-2的关系

CD4+富集的小鼠脾细胞先用1M VPD450共孵育10分钟，然后细胞用抗CD3/CD28 抗体刺激后在规定时间内收集。收获前4-6小时，细胞用PMA/离子霉素刺激，同时加入BD Golgistop™ 蛋白转运抑制剂。细胞经固定破膜后，用IL-2抗体染色后在BD™ LSR Ⅱ流式细胞仪上检测。

 

 

检测细胞周期最常用的方式就是检测细胞DNA含量，正常生长的细胞都会经历分裂过程，G0/G1期是两倍体时期，S期DNA开始合成，到G2/M期，细胞处于四倍体时期，之后细胞一分为二，进入下一个细胞周期。

特性	染料	固定破膜	特点	激光
细胞膜不通透性	PI	是	最常用	蓝黄绿激光
	DAPI	是	CV值最小	紫外激光
细胞膜通透性	Hoechst33342	是，但活细胞也可	活细胞标记	紫外激光

细胞实验案例：

Distribution of cell cycles in Jurkat cells and the bivariate distribution of DNA content (Hoechst 33342), RNA content (pyronin Y), and mitotic phosphoproteins (MPM-2-Cy5 fluoresence) in Jurkat cells. 

 

Cell cycle analysis of fluorescent reporter brains (top panels). GFP positive cells from a transgenic reporter line were gated out from GFP negative hindbrain cells based on a GFP negative sample (bottom panels). Histograms showing cell cycle phase distribution of the different cell 

 

细胞周期实验操作Protocol

细胞周期和细胞增殖相关研究方法总结:

检测指标	试剂	机制	方法	样品类型
DNA	PI、7-AAD	掺入到DNA双链中	流式	固定、破膜的样品，用于在完整细胞中区分活/死细胞
细胞染料	BD HorizonTMVPD450	在活细胞中扩散并被细胞内非特异性酯酶水解而形成荧光产物	流式	活的增殖细胞
新合成的DNA	BrdU和BrdU抗体	脱氧尿核苷(BrdU)在单链DNA中代替脱氧胸腺嘧啶苷（T），随后用BrdU抗体进行检测	流式、细胞成像，免疫组化	固定、破膜的细胞、处理过的组织样品（仅适用于细胞成像、免疫组化）
蛋白水平	Ki67、PCNA抗体	细胞增殖时表达增加	流式、生物成像、免疫组化、westernblot	固定的细胞、组织和提取物
蛋白水平	细胞周期蛋白、视网膜母细胞瘤(Rb)抗体、其他细胞周期标记	在细胞周期的不同阶段表达水平会有相应的上调或下调	流式、生物成像、免疫组化westernblot	固定的细胞、组织和提取物
蛋白修饰	磷酸化组蛋H3，细胞周期依赖激酶(cdk)抗体	细胞增殖或细胞周期变化时发生的蛋白磷酸化	流式、生物成像、免疫组化westernblot
BD CBA （定量检测）	固定细胞、组织、提取物