qPCR这件“小”事儿

荧光定量 PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）也称作实时荧光定量 PCR。常被大家叫做qPCR。顾名思义，qPCR能够对起始样本精准定量分析的技术。被广泛的应用于分子生物学以及医学的各个领域，大家一起来了解下吧！

qPCR原理

将荧光基团加入到PCR的整个反应体系中，在PCR反应过程中产物逐渐积累，荧光信号强度也会随之等比例增加。每经过一个PCR循环会收集到一个荧光信号，通过荧光强度变化进而检测产物量的变化，最终仪器上得到一条荧光扩增曲线图，图中横坐标表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

qPCR 扩增曲线图

我们在扩增曲线中看到几个名词，来分别看看他们的意思吧。

荧光扩增曲线：

可以分为一下三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期）、荧光信号指数扩增阶段和平台期。基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化；而在平台期，扩增产物不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始DNA拷贝数；只有在指数期，也就是荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，最适合进行样本原始样本量分析。

基线：

在 PCR 的最初几个循环中（一般为 3-15 个循环）的信号水平。此阶段的荧光信号变化量极小，接近一条直线，低水平的基线信号相当于反应的背景或噪声。每个实时荧光定量 PCR 反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析。

荧光阈值：

一般将PCR 反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，阈值是PCR反应3-15个循环荧光信号的10倍，荧光阈值可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上。

CT 值：

CT值是实验中最直观得到的数值，是指PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，也就是说在阈值固定的情况下，原始样本量越大，CT值越小哦！

溶解曲线：

熔解曲线(Melting curve)是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。这里需要再引入一个名词，也就是溶解温度，总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度(Tm)，不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。由此可以得到溶解曲线的重要性，在观察溶解曲线时通过观察Tm值温度得到扩增情况哦，如果只有单一峰，并且出峰位置就是你要的退火温度，恭喜你，实验成功！小tip:探针法不需要溶解曲线哦，染料法专属工具~

标准曲线：

标准曲线是一条函数方程，需要我们自己得出。把已知拷贝数的标准品做被系列稀释，进行qPCR得到CT值，几个已知横纵坐标的点就能得到一条函数曲线啦！我们在检测目的样本时，通过qPCR获得CT值，通过标准曲线就能计算出该样本的起始拷贝数！

染料法or探针法？

荧光基团的标记分为染料和探针进行标记，实验中如何选择标记方法呢？染料法原理为染料与双链DNA小沟结合进而指示扩增产物，不过存在的问题是染料法检测的是体系中所有双链DNA，所以一些非特异性扩增或引物二聚体会影响结果的真实可信性。大部分mix中会添加ROX，作为内部荧光参照，矫正背景信号。

探针类荧光定量 PCR 是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物，与染料法最大的区别在于，理想情况下探针法中的荧光信号值来源于目标序列，不会手非特异性阴性及引物二聚体的影响。在成本上也会相对较高。

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• 高稳定性：可兼容多种仪器，均可实现高灵敏度的扩增和定量结果。

• 超快速：热启动酶结合Q-bond分子。缩短反应时间，理论时间12min 。

• 超直观：内置颜色指示剂，预混液含有蓝色惰性染料，防止加样出错。。

• 超便捷：反应体系在室温可存放高达10h。