RNA 提取技巧和注意事项

RNA是单链结构，所以极其容易降解。并且核糖核酸酶 (RNase)非常稳定和活跃，难以灭活，即使微量也足以破坏 RNA。这些都为RNA的提取增添的不少困难。
我们在实验室里，或多或少都有过RNA提不出来，或者降解了的经历。那么在RNA的制备过程中，有哪些具体问题需要注意呢？且听我细细道来！

如何进行样本的保存?

由于RNA极其容易降解，一旦采集生物样本，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。并且可能出现两种主要类型的变化。一种是基因的下调和 RNA 的酶促降解会导致非特异性和特异性 mRNA 种类的人工减少。二是某些基因会在样品的处理和加工过程中被诱导。这两种效应的结合会导致转录谱与真正的体内基因表达模式不同。所以样本的保存得当是准确基因表达分析的先决条件。
传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：1、立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；2、切成小块后立即投入液氮冷冻。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。
但是液氮保存及立即匀浆都有各自的缺陷。 立即匀浆的问题：样品不适合直接匀浆，采集样品的场所不允许做实验。 液氮保存的问题：没有液氮，不能将液氮带入采集样品的场所，液氮保存样品的抽提操作很麻烦等。所以针对样本保存，QIAGEN有专门的样本RNA保存液及保存管。不需用液氮、干冰，并且耐受多次反复冻融，同时可以常温保存3-7天，携带方便。

货号	名称	说明
76014	RNAprotect Tissue Reagent (50 ml)	组织保存液
76154	RNAprotect Tissue Tubes (50 x 1.5 ml)	组织保存管（包含保存液）
76526	RNAprotect Cell Reagent (250 ml)	细胞保存液
762165	PAXgene Blood RNA Tubes	全血保存管
76506	RNAprotect Bacteria Reagent	细菌保存液

如何确保起始样本已经充分破碎呢？

纯化RNA前起始样本的充分破碎和均质十分关键。高效的破碎可破坏组织结构、细胞壁和细胞质膜，有利于RNA的充分释放；均质可降低细胞破碎后的粘度，有利于RNA的纯化。

目前样本破碎及匀浆的方法有以下2点：

• 1. 利用研钵、研杵破碎样本后可以利用带有针头的注射器吹打匀浆

• 2. 利用机器研磨及匀浆。

基因组DNA如何去除？

在RNA实验中，基因组DNA（genomic DNA，gDNA）的污染比RNA的提取更让人头疼，因为DNA的污染经常会让我们后续实验中出现假阳性结果。那么我们怎么才能解决RNA提取中基因组的污染问题呢？

1. 引物设计
在设计引物时推荐设计跨内含子引物，这样在下游做定量PCR时，可以通过扩增检测是否有gDNA的污染。
2. 在RNA纯化过程中去除gDNA
使用Trizol法提取时，氯仿分相后吸取上清时切记宁少勿多。一定不要用枪头吸到中间相，可以少吸一点上清。
一些商品化试剂盒带有gDNA的去除柱或者搭配DNase去除gDNA

货号	名称	说明
74034	RNeasy Plus Micro Kit (50)	从细胞和组织中快速纯化总RNA（带有gDNA去除柱）
74134	RNeasy Plus Mini Kit (50)	从细胞和组织中快速纯化总RNA （带有gDNA去除柱）
79254	RNase-Free DNase Set (50)	用于RNA纯化过程中的DNA酶消化

3. 可以选在在逆转录过程去除gDNA,目前大部分逆转录试剂盒中含有gDNA去除的试剂。

货号	名称	说明
205411	QuantiNova Reverse Transcription Kit (50)	逆转录试剂盒

RNA的质量如何判断？

1. 凝胶电泳法

通常，使用电泳判断 RNA 的完整性。理论上，完整的 RNA 拥有 28S:18S = 2:1。如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好。如果条带有弥散，拖带说明RNA有降解。

2. 紫外分光光度计

通常，使用 A260/A280 判断 RNA 的纯度，纯的RNA 的A260/A280 比值接近于2，如果有明显的蛋白质和酚污染，A260/A280<2.0。A260/A230可用于评估有机化合物和高离液盐的污染，理想情况下，A260/A230接近于2。

3. Agilent 2100

公认的 RNA 完整性测定标准，通过 RIN（RNA 完整值）和 DV200 指数实现对总 RNA 客观的完整性分析。RIN的范围1-10，RIN>7说明RNA的完整度较好。如果RIN介于6,7之间，有可能能得到好结果，但建议还是重新提取。当然如果样本很珍贵，可以试一试。