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小优Details-如何做好NRF2

时间:2021-09-28 10:12:16 浏览次数:263

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1、    引言

氧化应激(Oxidative Stress,OS)由于活性氧(自由基)的产生和抗氧化防御之间的平衡紊乱,引起的组织损伤,可导致多种疾病,比如神经系统(帕金森病、阿尔茨海默病)、心血管疾病(高胆固醇血症和动脉粥样硬化、中风、心肌梗塞等)、生殖系统疾病或自身免疫疾病等。NRF2是在OS反应中起关键作用的转录因子。在稳态条件下,KEAP1结合 NRF2,并将其保留在细胞浆内,进行泛素介导的降解,维持较低NRF2水平。少量组成型胞核 NRF2 通过调节抗氧化剂反应基因的基础表达来维持细胞稳态。在OS后,KEAP1 释放 NRF2,从而使激活剂转位到细胞核与抗氧化反应元件ARE 元件基因结合,导致细胞保护基因的表达,比如GSH、HO-1、NADP(H)、NQO1等。

图1 Nrf2与炎症通路的调控(R. Wang,2020)

目前研究氧化应激的老师很多,NRF2鉴于它的特殊性,是其中一个比较难做的指标。做NRF2我们需要注意什么呢?我们接下来仔细分析一下。

2、NRF2的注意事项

a.    WB检测限-细胞中较高的蛋白水平
从HPA(The Human protein Atlas)可知NRF2的在各组织中的基因表达水平尚可,但在稳态下NRF2的实际蛋白水平是很低的,不断地经过泛素-蛋白酶体途径被降解。

图2 NRF2在人源细胞系中的基因表达水平(HPA)

图3泛素-蛋白酶体途径


需要氧化应激/亲电子试剂(如图4左,亚砷酸盐50 μM,8 h,)处理导致(KEAP1) E3 泛素连接酶复合物失活,或者蛋白酶体抑制剂(如图4右,MG132 10 μM,10 h)处理令其不被降解。
 

图4 不同处理NRF2的蛋白表达情况(CST)

b.    翻译后修饰

根据Uniport可查到NRF2有多个翻译后修饰 (PTM)。其中磷酸化Ser40和乙酰化促进其核定位,并易位到核内。糖基化阻止了小 Maf 蛋白的异二聚化,从而削弱转录因子活性。入核后,通过FN3K的去糖作用恢复活性,与Maf形成异二聚体,结合ARE发挥作用。

图5 NRF2的几种修饰和异二聚体的形成

c.    NRF2条带位置的争议

由于抗体生产方面的原因,一直以来许多研究者认为Nrf2是以预测的55-65 kDa 的分子量迁移,该预测是根据 Nrf2 的开放阅读框大小 2.2-kb 做出的。Alexandria Lau在2013年通过化学刺激、哺乳动物过表达和重组蛋白表达提供了证据,证明NRF2实际条带应该在95-110KD。此后抗体厂家也纠正了这个错误,目前标注的实际条带位置都在95-110KD。

图6 Nrf2条带位置的验证

在具体的实验时,有的老师可能会遇到无条带、非特异带、高背景或者条带位置不对的情况。针对这些情况出现的可能原因,小优进行了一一分析,并给出了相应的解决方案。

3、    常见问题的原因分析

a.    无条带:样品未经合适处理;降解或提取不充分;抗体不工作
 
b.    非特异带:样品降解;同型或者修饰;多聚体;漂洗不充分;抗体非特异
 
c.    高背景:样品降解;试剂或操作污染;漂洗不充分;PVDF膜;抗体非特异
 
d.    条带位置不对:样品降解,胶浓度,抗体不特异
 
4、    解决方案

a.    设置阳性对照,选择合适的处理(MG132,氧化应激)作为阳性样品;样品新鲜制备;被Keap1释放后入核,裂解时强烈建议超声处理,或者用专门的核提取试剂盒;增加上样量((细胞20ug,组织50-100ug));更换抗体。

b.    新鲜制备样品;同型/修饰换其他细胞样品看看;存在异源二聚体,因此loading buffer中还原剂(0.6MDTT或者5%B-ME)要有效,可另外添加;加强漂洗,增加漂洗液中的NaCl 浓度(150mM-500mM)和Tween浓度(0.1-0.5%);更换抗体。

c.    新鲜制备样品;实验中试剂包括电泳液、转膜液、漂洗液、脱脂奶粉、抗体稀释液等用新鲜配制的,海绵也要洗干净,滤纸换新的,操作时用镊子夹边缘不要用手触摸,孵育时放平,不要弯曲导致孵育不均,膜干掉;加强漂洗,增加漂洗液中的NaCl和Tween浓度;使用NC膜背景会相对低点;更换抗体。

d.    新鲜制备样品;使用梯度胶,排查问题时孵全膜;更换抗体

或者以下表形式排版

常见问题 原因分析 解决方案

无条带/弱条带   

样品未经合适处理;
降解或提取不充分;

抗体不工作

1.    设置阳性对照,选择合适的处理(MG132/氧化应激)作为阳性样品;
2.    新鲜制备,被Keap1释放后入核,裂解时强烈建议超声处理,或用核提取试剂盒,增加上样量(细胞20ug,组织50-100ug);
3.    更换抗体

非特异带

样品降解;
同型/修饰;
多聚体;

漂洗不充分;

抗体非特异

1.    新鲜制备样品;
2.    换其他细胞样品;
3.    存在异源二聚体,loading buffer中还原剂(0.6MDTT/5%B-ME)要有效,可另外添加;
4.    加强漂洗,增加漂洗液中的NaCl 浓度(150mM-500mM)和Tween浓度(0.1-0.5%);
5.    更换抗体
高背景

样品降解;
试剂/操作污染;

漂洗不充分;

PVDF膜;

抗体非特异

1.    新鲜制备样品;
2.    电泳液、转膜液、漂洗液、脱脂奶粉、抗体稀释液等用新鲜配制的,海绵洗净,滤纸换新,用镊子夹边缘不要用手触摸,孵育时放平,不要弯曲导致孵育不均,膜干掉;
3.    增加漂洗液中的NaCl和Tween浓度;
4.    使用NC膜背景会相对低点;
5.    更换抗体

条带位置不对

样品降解;
胶浓度;
抗体不特异
1.    新鲜制备样品;
2.    使用梯度胶,排查问题时孵全膜;
3.    更换抗体


 
无条带/弱条带    样品未经合适处理;

5、NRF2相关抗体

货号 靶点 产品名称
12721 NRF2 NRF2 (D1Z9C) XP® Rabbit mAb
8047 KEAP1 KEAP1 (D6B12) Rabbit mAb
43966 HO-1 HO-1 (E3F4S) Rabbit mAb
8242 p65 NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit mAb
3033 p-p65 Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit 
5114 p62 SQSTM1/p62 Antibody
9242 IκBα IκBα Antibody
2859 p-IκBα Phospho-IκBα (Ser32) (14D4) Rabbit mAb

Reference:
1. Molecular Mechanisms of Nrf2 in Inflammation: Interactions Between Nrf2 and Inflammatory Mediators
2. The Predicted Molecular Weight of Nrf2: It Is What It Is Not
3. https://www.uniprot.org/uniprot/Q16236
4. https://www.proteinatlas.org/ENSG00000116044-NFE2L2/celltype

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