蛋白纯化入门:纯化原则及策略

蛋白纯化已经成为近年来越来越热门的技术。无论是研究蛋白机制，蛋白通路或者蛋白的相互作用，在文章中加上蛋白纯化的内容，都会使文章更具有说服力，是简单拿高分的神器哦！

首先让我们先来一起了解一下什么是蛋白纯化吧。蛋白纯化是生物研究常用的一种技术，是指从蛋白混合物中得到纯度较高的某种蛋白的过程。

蛋白纯化的指导原则

1、  明确目标

对于纯化样品，应该要明确最终产品需要达到的纯度、活性和产量的要求，要避免过度纯化或者因为纯化步骤或者分辨率不够而达不到想要的纯度。

2、  明确目标样品的特性和关键杂质

根据样本和杂质的特性选择适合的纯化方法，纯化技术的选择要简单化，并且要产生最佳的纯化效果。

3、  明确检测分析技术

能快速和准确的检测样品活性，纯度和回收率。

4、  合理安排纯化步骤  

尽可能少用添加剂和尽可能早的去除对样品有损伤的杂质，并且要减少额外的纯化步骤。

三步纯化策略

通常需要多步纯化来达到预期的样品纯度，然而每一步纯化步骤都会导致产物的丢失。例如，假定每一步能够获得80%的得率，那么经过8个纯化步骤后，总得率将被减少到仅仅20%。因此，使用最少的步骤和最简单可行的设计来达到预期的产量和纯度是非常必要的。各种技术应该以较优的顺序组合起来，避免改变样本条件的步骤，恰当的选择和设计可以使纯化步骤尽可能的少。

在蛋白纯化中一般可以选择三步纯化策略。

在样品捕获阶段，将目标物进行分离，浓缩并对目标物进行稳定化处理，关键的污染物被大量去除。在中度纯化阶段，样品中的大量杂质都已被去除。在精细纯化阶段，由于之前大量杂质都已被去除，仅需去除剩下一些痕量的杂质。

当然，也并不是所有的纯化策略都必须经过三个纯化步骤。如果对纯度要求较低时，一步或者两步纯化就可以获得想要的结果。

纯化类型选择

根据不同的蛋白特性，有4种纯化柱类型可以选择。

在纯化过程中，需要考虑到回收率，分辨率，速度和容量等因素，每种不同的纯化技术都会有不同的表现。可以根据样品的性质来进行正确的选择和组合。

三步纯化策略中一般的推荐选择是：

纯化策略

1、捕获阶段

在样品捕获阶段，通过将速度和容量进行优化组合，使样品中的目标产物被有效的分离、浓缩和稳定化处理。

捕获阶段一般选择亲和层析，离子交换层析或者疏水层析，通过吸附作用使样品和杂质实现分离。如果样品带有标签，第一步可以选择标签蛋白亲和层析；如果样品不带有标签，可以考虑使用离子交换/疏水层析。由于捕获阶段一般样品量较大，杂质较多，所以捕获阶段分辨率不是特别主要考虑的因素，可以主要考虑增加上样量和速度。

2、中度纯化阶段

在中度纯化阶段，应将注意力集中于将目标样品和大多数大体积的杂质分开。在中度纯化阶段，速度不是最重要的因素，因为经过捕获阶段样品体积会缩减。中度纯化阶段一般建议使用离子交换层析或者疏水层析进一步提高样品的纯度。

3、精细纯化阶段

在精细纯化阶段，关注的重点就是如何达到高分辨率，从而完成最终的纯化。在此前的步骤中已经去除了大部分的污染物和杂质。如果需要达到较高的分辨率，可能会在此步骤造成一些回收率的损失。精细纯化阶段一般建议使用高分辨率的分子筛或者高分辨率的离子交换层析柱。