小G蛋白研究效率加倍的秘密，你知道吗？

近年来，小G蛋白在免疫药物的研究中已成为又一热点领域。小G蛋白的主要功能为介导信号转导，它在细胞骨架重组，细胞极性，细胞周期进程，基因表达，以及其他众多的生物事件中起到关键作用。因此，研究小G蛋白作用机制具有重要的免疫医学意义，尤其在小分子医药领域。所以，如何高效筛选小G蛋白的激活剂/抑制剂药物已成为当今抗癌药物筛选的热门话题。

科学家们对小G蛋白的研究如火如荼，从中发表的高分文章也层出不穷。下面小优就为大家分享一篇关于小G蛋白调控机制的高分文献。

心血管疾病如今仍然是中老年人群体中最常见和最致命的疾病之一，科学家们对心血管疾病的致病机理与治疗手段仍进行着热烈的研究中。

科学家发现血管平滑肌细胞（VSMC）是血管壁主要的形成细胞类型，VSMC肌球蛋白的活性与形态变化在心血管疾病中起关键作用。

本篇文章作者在分子水平对VSMC肌动蛋白的细胞骨架调节因子进行了深入研究，发现Sad1 and UNC84 domain containing proteins 1/2（SUN1/2）在调控VSMC的多态性、调控肌动球蛋白活性、RhoA活性中起关键作用。

而RhoA参与调控VSMC肌动球蛋白的活性与多态性，其分子机制与LInker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC) complex有密切关系。该文章动物实验证实了基因敲除SUN1/2后改变了VSMC的生长并损害了RhoA活性。

1. SUN1/2的敲除引起了肌动蛋白cap的重新组合。

A&B. SUN1和SUN2敲除的血管平滑肌细胞（VSMC）裂解物的WB实验结果；

C&D. SUN1和SUN2敲除的VSMC细胞在12kPa水凝胶上生长的共聚焦免疫荧光成像结果；

E.VSMC细胞所含actin cap的数量；

F.VSMC细胞所含bright或faint actin cap的数量。

WB实验验证了si-RNA处理VSMC后SUN1/2的有效清除；单独清除SUN1或SUN2后，actin cap的调控受到明显影响；共聚焦IF成像验证了SUN1/2清除的VSMC中actin cap受到了重新组合。

2. SUN1/2影响VSMC的生长延伸

A.VSMC共聚焦免疫荧光成像结果，红色为罗丹明鬼笔环肽，绿色为SUN1/2，蓝色为DAPI；

B.细胞总区域体积分析；

C.细胞核区域体积分析；

D.细胞核区域体积：细胞质区域体积比率分析。

该部分分析了SUN1/2的清除对VSMC多态性的影响。从共聚焦IF结果可以看出，VSMC细胞总体积与细胞核体积均因SUN1/2的清除而下降；细胞质的比率明显上升。该结果证实了SUN1/2在VSMC细胞多态性中起到关键作用，对其生长延伸产生重要影响。

3. SUN1/2影响VSMC中RhoA和肌动球蛋白活性

A.SUN1/2清除的VSMC牵引力热成像（traction force microscopy,TFM）结果；

B-D.对照组、SUN1和SUN2清除的VSMC整体牵引力（integrated-TS）、最大牵引力（maximal-TS）、细胞平均牵引力（cell average-TS）结果；

E.G-LISA检测不同处理组中VSMC中RhoA活性，结果以GTP-RhoA：总RhoA比率表示；

F.WT和SUN2基因敲除VSMC的TFM结果；

G-I.WT与SUN2基因敲除的VSMC整体牵引力（integrated-TS）、最大牵引力（maximal-TS）、细胞平均牵引力（cell average-TS）结果；

J.G-LISA检测WT与SUN2基因敲除VSMC中的RhoA活性，结果以GTP-RhoA：总RhoA比率表示。

之前部分的实验已验证SUN1/2对VSMC多态性的影响，而肌动球蛋白和RhoA活性提供的牵引力在细胞延展过程中起关键作用。这一部分实验为验证SUN1/2对肌动球蛋白和RhoA活性产生调控作用，采用牵引力热成像技术与G-LISA检测方法，综合测定了SUN1/2清除后VSMC牵引力与RhoA活性的变化。

从热成像结果可以看出，SUN1/2的清除或是SUN2基因的敲除明显降低了VSMC中整体牵引力、最大牵引力、细胞平均牵引力；同时，G-LISA检测结果表明，因SUN1/2的清除或SUN2基因缺失，活化的RhoA（GTP-RhoA）比率显著降低。综合两种结果，作者证明了SUN1/2对RhoA活性具有正调控机制，而RhoA活性保证了VSMC的正常生长与延伸运动。

该实验从小G蛋白活性的角度出发，发现并验证了SUN1/2两个蛋白对血管平滑肌细胞多态性、运动以及生长起到显著的调控作用，而其调控机制正是基于对小G蛋白RhoA活性的调控。该文章为小G蛋白的调控的研究提供了新靶点，在今后的免疫药物筛选中或将提供新的思路。

小优也为大家总结了文章中所用的产品哟~

货号	产品描述	品牌
BK121	RhoA G-LISA Activation Assay (luminescence)	Cytoskeleton
BK036	RhoA Pulldown Activation Assay Kit	Cytoskeleton
CN01-A	Rho Activator	Cytoskeleton
CT04-A	Cell Permeable Rho Inhibitor (C3 Trans based))	Cytoskeleton
NA931	MOUSE IGG HRP LINKED WHOLE AB	Cytiva
abs132001	Beta actin antibody	Absin

那么，什么是小G蛋白呢？

我们熟知的G蛋白在众多生物过程中起着重要的调控作用，被称为细胞的“分子开关”。G蛋白是一类具有鸟苷三磷酸水解酶活性（GTPase），能与鸟苷二磷酸（GDP）相互作用的信号转导蛋白。基本调控机制如下。

G蛋白介导胞外信号传导。胞外信号首先由G蛋白偶联受体（GPCRs）接受，受体被活化后激活膜内侧异三聚体G蛋白，GTP偶联的G蛋白变为激活状态，与酶作用产生胞内第二信使信号物质，从而逐级调控下游各效应器，调节生物过程。

近年来，科学家们发现还有另外一类具有与G蛋白相似功能的信号传导蛋白，科学家们将其命名为小G蛋白（small G proteins）。这类蛋白同样具有鸟苷酸结合位点、GTP酶活性、受鸟苷酸调控，但结构与G蛋白不同，分子量较小，约为20-30kDa，不以α、β、γ三聚体形式存在，为单体分子。

小G蛋白的激活/失活循环机制。胞外信号介导鸟苷酸交换因子（GEF）激活，加速小G蛋白从非激活状态（GDP偶联）转变为激活状态（GTP偶联）。在激活状态下，小G蛋白与下游效应因子互作传导胞内信号，从而产生不同的细胞反应。GTpase激活蛋白（GAP）另一方面能促进GTP水解，并使小G蛋白回归失活状态。

现已发现最具代表性的小G蛋白是Rat Sarcoma（Ras）蛋白，它是第一个被发现的小G蛋白，其super family成员数超过150个，根据序列同源性分为不同亚家族，其中包括Rho, Cdc, Ran, Rab, Arf以及Rad, Rem, Gem, Kir等

什么又是G-LISA分析方法呢？

研究小G蛋白的方法包括Pull-down与G-LISA检测。Pull-down实验又叫蛋白质体外结合实验，可用于测定活性的GTPase亚型，可作为对G-LISA实验的补充。

G-LISA实验是一种改进的ELISA，可测定3-D细胞系、原代细胞裂解液及组织裂解液中有活性的GTPase，使GTPase定量的准确性增加。

为什么G-LISA更优质、更高效？

传统Pull-down技术相比于G-LISA往往存在许多劣势，如耗时长、样本需求量大、低通量等。如下是两种技术的比较。

1. 预先将能与激活态GTPase结合的效应蛋白包被于96孔板上。加入细胞裂解液样品（含激活态GTP-GTPase与非激活态GDP-GDPase）。

2. 激活态GTP-GTPase与效应蛋白特异性结合被捕获，非激活态GDP-GTPase在用wash buffer洗板后被冲走。

3. 加入anti-GTPase一抗进行孵育，与96孔板捕获的激活态GTP-GTPase特异性结合。

4. 加入HRP二抗孵育，与一抗结合。

5. 最后加入HRP底物与二抗发生显色反应，根据捕获的激活态GTP-GTPase数量不同，酶标仪或分光光度计得到不同吸光度读数。

依据此原理便能定量检测样品中的各类激活态小G蛋白。

G-LISA实验视频介绍：（https://www.cytoskeleton.com/glisa-technical-video）
Pull-down与G-LISA实验结果举例：

图1. Pull-down实验结果图。Swiss 3T3细胞血清饥饿24h; 之后，一个样本使用10ng/ml的EGF处理2min（lane 4&5）；其他细胞没有经过处理，保持血清饥饿（lane 2&3）。使用Rac1的 pull down实验测定Rac1的活性。使用10μg的PAK-PBD珠子测定500μg的裂解液（lane 2-5）。Lane 1是20ng的重组Rac1-His蛋白，作为WB的标准品。

图2. G-LISA实验结果图。Swiss 3T3细胞分别被Rho激动剂Ⅰ 货号CN01和货号LPA处理，细胞中的RhoA活性随时间变化。通过读取OD490nm的信号值，测定RhoA活性。

Cytoskeleton®作为该领域的领导者，其研发的新一代Pull-down和G-LISA试剂盒被公认为行业内的金标准，其检测方法与相应产品已被广泛发表于文献中。