【罗工流式宝典第1式】小鼠Treg细胞的鉴定、分离及体外抑制实验

罗工秘籍系列自2020年发布以来，就深受小伙伴们的欢迎。而自本周起，罗工又有新系列和大家见面了：罗工宝典，其中都是精心整理的完整实验操作方案，希望此系列可以对大家的科研有所裨益。

调节性T（Treg）细胞是CD4+ T细胞的一个亚群，它表达Foxp3作为转录因子。Treg细胞通过调节免疫反应，在免疫耐受和维持体内平衡中发挥着重要作用。Treg细胞的主要作用是抑制效应T（Teff）细胞的增殖和细胞因子如IFN-γ、TNF-α和IL-2的产生。研究表明，Treg细胞抑制Teff细胞功能的能力会在持续的病原体感染和癌症发展过程中增强。在参与T细胞抑制的因素中，表达程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）的终末耗竭性T（Texh）细胞和Treg细胞被广泛认为是抗原持久性和抑制环境的标志。Treg细胞表达PD-1的水平与其抑制T细胞增殖的抑制能力强弱相关。

图1. Treg细胞在癌症中的作用

实验前准备

步骤1	步骤2	步骤3
1.      RPMI培养基、FBS、双抗、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇 2.      FACS 缓冲液 3.      红细胞裂解液 4.      70μm滤器 5.      固定破膜试剂盒 6.      相关鉴定指标抗体、死活染料	1.      磁珠分选缓冲液 2.      Miltenyi细胞分离试剂盒 3.      Miltenyi分选柱 4.      40μm滤器	1.      细胞增殖试剂盒 2.      anti-CD3/CD28功能抗体或磁珠 3.      检测细胞因子ELISA试剂盒

1. 脾脏样本单细胞悬液制备与Treg鉴定

1） 脾脏淋巴细胞的分离

a) 取小鼠脾脏置于2% RPMI培养基（2% FBS+1% 双抗）中。

b) 使用注射器柱塞研磨，并通过70μm细胞过滤器，用2ml 2% RPMI培养基冲洗。

c) 补充适量2% RPMI培养基，4°C，300g离心5min，丢弃上清，用1ml 红细胞裂解缓冲液重悬细胞，室温孵育5min。

d) 加适量2%RPMI培养基中止裂解，4°C，300g离心10min，丢弃上清，在RPMI完全培养基（10%FBS+1%双抗+1%L-谷氨酰胺+50μM 2-巯基乙醇）中以1×107 cells/ml的密度重悬细胞，等待后续实验。

2） Treg细胞的表型分析鉴定

a) 转移50μl淋巴细胞（5×105 cells）到96孔板中，再加入150μl FACS缓冲液，4°C，300g离心2min。

b) 丢弃上清，再使用200μl FACS缓冲液洗2遍，4°C，300g离心2min。

c) 准备含抗体的染色缓冲液（50μl/孔，抗体用量参考说明书）：anti-CD4，anti-CD25，anti-PD-1，死活染料。

注意：为了进一步分析活化Treg细胞的表型，可添加anti-CD103进行细胞表面标记物染色。

d) 每孔用50μl抗体缓冲液重悬细胞，4°C避光孵育20min，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，4°C，300g离心2min。

e) 按厂家说明书制备固定缓冲液100μl，在4℃黑暗中固定细胞20min。用渗透性洗涤缓冲液(根据制造商的说明书准备)洗涤细胞2次，4°C，300g离心2min。

f) 制备细胞内Foxp3染色的抗体溶液（抗体用量参考说明书），用50μl 含anti-Foxp3抗体溶液重悬细胞。

g) 4°C避光孵育20min，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，4°C，300g离心2min。用200μl FACS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪检测细胞表型。

图2 小鼠脾脏Treg细胞表型分析

2. CD4+CD25+Treg细胞的分离纯化（磁珠分选）（Miltenyibiotec Cat: 130-091-041）

a) 按步骤1）获得1×107 cells/ml细胞悬液。加入10ml T细胞分离缓冲液清洗细胞。4°C，300g离心10min。弃去上清，用40μl缓冲液重悬细胞。

b) CD4+T细胞磁性标记：加入10μl生物素-抗体混合物搅拌均匀，4°C孵育10min。

c) 加入30μl缓冲液，20μl抗生物素微珠标记non-CD4+T细胞，10μl CD25-PE抗体。搅拌均匀，避光孵育15min。

d) 加入2ml缓冲液，将细胞通过一个40μm的细胞过滤器，到新的50ml的管中，清除细胞碎片。4°C，300g离心10min，丢弃上清，用500μl缓冲液重悬细胞，浓度最高可达1.25×108个细胞。

e) 收集通过分选柱的未标记细胞。加入2ml缓冲液清洗分选柱，4°C，300g离心10min。将分离的CD4+T细胞完全弃去上清，用90μl缓冲液重悬。

f) CD25+细胞磁性标记：加入抗PE磁珠10μl，混合均匀，4℃避光孵育15min。

g) 加入2ml缓冲液，4°C，300g离心10min，丢弃上清，用500μl缓冲液重悬细胞，浓度最高可达1×108 cells。

h) 富集CD4+CD25+Treg细胞：将细胞涂于柱上进行阳性选择，并加入2ml缓冲液冲洗柱。重复3次。

i) 当最后洗涤后柱为空时，在柱上加1ml缓冲液，用柱塞冲洗磁性标记的CD4+CD25+细胞。

j) 重复h-i步骤，提高分离的CD4+CD25+Treg细胞的纯度。用FACS缓冲液洗涤细胞，4°C, 300g离心10min。丢弃上清，将分离的CD4+CD25+Treg细胞重悬于RPMI完全培养基中，浓度为2×106 cells/ml。

k) 为了检测分离的CD4 +CD25+Treg细胞的纯度，从总分离的CD4+CD25+Treg细胞中提取的2×105个细胞。用50μl含anti-CD4和细胞活力检测试剂的FACS缓冲液。

l) 4°C避光孵育20min。用FACS缓冲液洗涤细胞， 4°C，300g离心2min。洗涤后用100μl FACS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪检测纯度。

m) 从活细胞中分析Treg细胞纯度，确认CD4+CD25+细胞纯度。

图3 Treg细胞分离后纯度分析

3. CD4+CD25+Treg和CD8+T体外抑制实验

a) 为了制备anti-CD3/CD28包被的磁珠：将适当体积的磁珠转移到15ml管中（2.5μl/1x105 cells）。 加入等体积的PBS并混合。4°C，300g离心2min，丢弃上清液。在完全培养基中稀释磁珠（50μl/孔）。

b) 取50μl CD4+CD25+Treg细胞（1×105 cells/孔）。每孔加50μl CD8+T细胞作为应答T (Tresp)细胞（1×105 cells/孔）。每孔加入50μl稀释后的anti-CD3/CD28。

注意：在此步骤中，标记和建立对照孔如下:未刺激CD8+T（不含anti-CD3/CD28）；刺激的CD8+T细胞（含anti-CD3/CD28）；刺激的Treg细胞（含anti-CD3/CD28）。Treg细胞可以用完全培养基稀释，以不同比例的Tresp细胞与Treg细胞（1:0.25-1:1）共培养。

c) 各孔加50μl或适当体积的培养基，总体积为200μl。用铝箔盖住板子，放入二氧化碳培养箱中37°C培养 72h。

d) 培养72h后进行细胞因子产生分析，将每孔上清液分离到另一个板上，进行酶联免疫吸附试验（ELISA），检测IFN-γ水平。

e) 将每孔上清液分离后，用FACS缓冲液清洗含有细胞的培养皿，4°C，300g离心2min，洗3次。

f) 洗涤后，弃去上清。用50 μl的抗体缓冲液（anti-CD4、anti-CD8和细胞活力检测试剂）重悬细胞，对增殖的CD8+T细胞进行染色（在获得CD8+T细胞时，可使用追踪细胞增殖的染料进行标记）。4°C避光孵育20min。

g) 4°C，300g离心2min，洗两次。洗涤后，弃上清，用100μl固定缓冲液4℃避光固定20 min。

h) 4°C，300g离心2min，洗两次。200μl FACS缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测标记CD8+T细胞增殖情况。

图4 活化的Treg细胞对CD8+T细胞应答的影响

体外抑制实验的优势在于，因为只有Tresp细胞与Treg细胞共培养，所以它可以直接评估Treg细胞对CD8+T细胞反应的抑制作用。除CD8+T细胞外，也可以通过改变实验条件来评估Treg细胞对其它免疫细胞(如树突状细胞或自然杀伤细胞)的影响。

参考文献：

[1] Park HJ, Oh JH, Ha SJ. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J Vis Exp. 2016 Jun 22;(112):54138. doi: 10.3791/54138. PMID: 27404802.

[2] Zeng G, et al. Regulatory T Cells in Cancer Immunotherapy: Basic Research Outcomes and Clinical Directions. Cancer Manag Res. 2020 Oct 21; 12:10411-10421. doi: 10.1016/j.bbmt.2014.11.001. PMID: 25459643.

[3] Park HJ, et al. PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells. J Immunol. 2015 Jun 15;194(12):5801-11. doi: 10.4049/jimmunol.1401936. PMID: 25934860.