高效基因筛选工具：去泛素化酶siRNA文库的应用

你是否还在为新基因功能的发掘而苦恼？想要让自己的研究与众不同、脱颖而出，却苦于没有找到有效的办法？文献看了一篇又一篇，眼睛花了、头发tu了，却仍然没有找到合适的突破口？

别担心，小编今天带着办法来咯！我们为大家准备了满满的干货，来介绍基因功能发掘界的“super star”——siRNA基因筛选文库，以及它的应用实例。这就安排！

那么，到底什么是siRNA文库呢？简单来说，siRNA文库就是多个单基因siRNA的集合，小到几十个基因的基因家族亚文库，大到几万个基因的全基因组文库。文库大多以96孔板形式提供，每孔对应一个基因，且因文库涵盖基因数量不同，拿到手的96孔板数也有所不同。

siRNA文库作为目前最高效的基因筛选方法之一，已逐渐成为科研界热捧的对象。很多实验团队借助siRNA文库，筛选出与自己研究领域相关的新的功能基因，高分文章发表因此so easy！

值得注意的是，美国的Dharmacon公司自1995年成立以来，一直致力于基因调控领域技术的不断迭代更新，是RNAi技术领域专利技术和知识产权最大的持有者，至今使用Dharmacon产品的CNS文章全球已超过3000篇。Dharmacon在2005年就推出了siRNA文库，2009年又推出了专利修饰款siRNA文库，目前能够检索到的应用siRNA文库筛选的文章，大多用到的产品都来自Dharmacon。

Dharmacon siRNA文库，涵盖各基因家族预制亚库及全基因组文库，文库内基因是基于GO基因本体论数据库生成的，基因与特定基因家族或功能的相关性也是通过数据库来确定的。Dharmacon有专业的技术团队去尽可能的覆盖文献报道中所有相关的基因，且会依据数据库内容，定期更新文库中的基因list。

为了全方面带大家领略siRNA文库功能的强大性，小编特意挑选了一篇文献，由普林斯顿大学分子生物学系和复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科团队于2020年发表在Genes & Development上，该文献是基于Dharmacon的siRNA去泛素化酶亚库来进行基因筛选的，我们来细细解读一番：

1 背景由来

SNAI2是 SNAIL 家族转录因子的三个成员之一，可增强乳腺癌干细胞的活性，与癌症转移、术后复发风险增加及癌症患者生存期缩短相关。尽管 SNAI2 在调节乳腺癌转移中起关键作用，但目前还没有直接靶向 SNAI2 的药学有效方法。由于去泛素化酶（DUB）  比转录因子 SNAI2 本身更易成药，识别和稳定 SNAI2 的 DUB 可以作为降低 SNAI2 水平和抑制肿瘤进展的新药物靶点。为了鉴定可去泛素化和稳定SNAI2的DUB，作者使用人的去泛素化酶siRNA文库和cDNA文库进行了全面的功能增强和功能丧失筛选。

2 siRNA文库筛选方法

• 细胞：乳腺癌细胞系MDA-MB-231，该细胞系具有相对较高的内源性 SNAI2 表达。
• 文库：human DUB siRNA library（购自Dharmacon），涵盖98个DUB基因，每个基因含4条siRNA，等比例预混形成一个Pool。
• 初轮筛选：

1. 将文库中的98个基因对应的98个siRNA pool分别转染至MDA-MB-231细胞中；
2. SNAI2 siRNA 作为阳性对照，以确认siRNA转染效率一致性；
3. 转染48小时后收集蛋白质裂解物；
4. Western blot检测98个DUB基因敲低后SNAI2的表达情况

• 二轮筛选：

1. 选择初轮筛选中得到的最显著降低SNAI2水平的前20个DUB基因进行二轮筛选；
2. 与初轮筛选不同的是，这次将每个基因对应的4条单独的siRNA分别转染MDA-MB-231细胞；
3. 挑选每个基因4条siRNA中达到最低SNAI表达水平的进行对比

3 文库筛选结果

• 初轮筛选结果：

根据WB结果，挑选出最显著降低SNAI2水平的前20个DUB基因，其中包括：CYLD, STAMBP, USP19, USP20, USP52, USP29, USP31, USP3, USP34, USP33, USP36, USP37, USP53, USP6, USP32, USP5, USP51, USP7, C13ORD22, ZA20D1。

A

图A. 去泛素化酶亚库98个基因siRNA敲低后，WB结果显示对应的SNAI2表达情况

B

图B. 初轮筛选结束后，SNAI2表达水平最低的20个基因被标红，将标红基因挑选出来进行二轮筛选

• 二轮筛选结果：

在20个候选基因中，USP20和USP52的敲低导致SNAI2蛋白水平显著下降。

C

图C. 二轮筛选评估结果

4 讨论

为了进一步验证候选基因，作者使用DUB cDNA文库进行筛选，通过免疫共沉淀实验检测文库中DUB基因与SNAI2相互作用关系，最终挑选出了20个与SNAI2相互作用的DUB基因，其中包括USP20。基于DUB siRNA文库和DUB cDNA文库两次筛选的重叠结果，USP20作为最有希望的候选靶点成为本研究的重点。

作者为了进一步研究USP20在调节 SNAI2 稳定性方面的作用，通过 Transwell 迁移和侵袭试验，证实USP20 对细胞迁移和侵袭的影响是由 SNAI2 介导的。又进行了小鼠体内实验，研究USP20对乳腺癌细胞肺转移的影响，结果表明USP20 的敲低抑制了乳腺癌的肺定植，从而减少了转移结节的形成。在收集到的84名乳腺癌患者样本（来自复旦大学上海癌症中心）中，免疫组化结果表明USP20能够稳定SNAI2，这两种蛋白质的表达模式呈显著的正相关。

综上，DUB siRNA文库筛选为乳腺癌的治疗选择提供了新的思路。筛选得到的DUB USP20作为最有前景的临床相关性治疗靶点，可通过间接抑制蛋白酶USP20来降低乳腺癌患者的SNAI2水平，针对 USP20 的选择性抑制剂可通过结构引导设计和筛选来进行后期的开发。这种DUB选择性抑制剂能够靶向更具体的作用途径，从而在达到更好疗效的同时，不附带任何副作用。

5 文献好物推荐

货号	品名	规格	品牌
G-104705-01	Human ON-TARGETplus Library-Deubiquitinating Enzymes-SMARTpool	0..1nmol	Dharmacon
GU-104705-01	Human ON-TARGETplus Library-Deubiquitinating Enzymes-Set of 4	0.1nmol	Dharmacon
J-017386-06-0002	ON-TARGETplus Human SNAI2 (6591) siRNA - Individual	2nmol	Dharmacon
D-001810-01-05	ON-TARGETplus Non-targeting siRNA #1	5nmol	Dharmacon

除了本文中使用到的去泛素化酶siRNA亚库，Dharmacon还提供多种热卖siRNA文库，具体如下：

文库范围	基因数（Human）	基因数（Mouse）
Genom	~19000	~20000
Druggable Genome	7553	6457
Drug Targets	4786	5144
Protein Kinases	709	742
Epigenetics	463	/
GPCR	390	571
Ion Channels	349	335
Phosphatases	254	220
DNA Damage Response	240	/
Membrane Trafficking	140	/
Cell Cycle Regulation	131	128
Cytokine Receptors	116	/
Tyrosine Kinases	88	/
Nuclear Receptor	52	/
Ubiquitin Conjugation Subset 1	87	80
Ubiquitin Conjugation Subset 2	115	103
Ubiquitin Conjugation Subset 3	386	329
Deubiquitinating Enzymes	98	126

Tips: 如果您对siRNA文库感兴趣，可直接联系您身边的优宁维销售，也可通过以下方式联系我们：

杨玉倩（分子产品专员）

13914767602（可加微信）

yangyq@univ-bio.com