华中农大基于下一代测序NGS研究牛星状病毒基因型

来自武汉华中农业大学的老师研究牛星状病毒基因型的文章“Prevalence of bovine astroviruses and their genotypes in sampled Chinese calves with and without diarrhoea”发表在Journal of General Virology上，使用下一代测序（NGS）方法组装了九个 BoAstV 菌株的近乎完整的基因组序列。在氨基酸和核苷酸水平上与已知星状病毒 (AstV) 菌株的序列比对显示出高度的遗传多样性，鉴定了四种基因型，此外九个 BoAstV 菌株中有七个显示出可能的基因型间重组和跨物种重组。因此，其研究结果增加了对 BoAstV 流行率和遗传进化的了解，并为 BoAstV 感染与小牛腹泻之间的关联提供了证据。
目前很少有研究涉及 BoAstV 的流行和遗传多样性及其与小牛腹泻的关联，这可能是由于难以从细胞和组织培养物中分离这种病毒以及腹泻和无症状动物的高比例合并感染。幸运的是，目前的下一代测序（NGS）方法可以有效替代传统的细胞培养来识别 BoAstV 和其他共感染病毒。考虑到这一点，本篇文献旨在基于最近使用 NGS 方法从广泛地区收集的样本，通过调查中国有和无腹泻小牛中 BoAstV 的患病率和基因组特征来确定 BoAstV 与小牛腹泻之间的相关性。结果，在 BoAstV 感染和小牛腹泻之间观察到很强的相关性，除了已知的 MAstV-28 和 MAstV-33 之外，还鉴定了两种新的基因型并命名为 MAstV-34 和 MAstV-35。老师的发现对于制定针对与小牛腹泻相关的 BoAstV 的控制措施具有重要意义。最后，数据证实了 BoAstVs 的重组，这进一步暗示了它们的跨物种传播。这些发现为制定预防和控制 BoAstV 引起的犊牛腹泻的新措施提供了重要的流行病学证据。
将164 份来自腹泻和无症状小牛的粪便样本处理好之后，用QIAamp Viral RNA/DNA Mini Kit（QIAGEN，德国）提取病毒RNA，用QIAseq Fast Select-rRNA HMR Kit（QIAGEN，德国）去除rRNA。之后，使用 QIAseq FX DNA Library Kit（Qiagen，德国）制备 cDNA 文库，并使用 MiSeq 台式测序仪（Illumina）在武汉完成测序以及数据的分析。
为了验证从 NGS 获得的九个 BoAstV 菌株的基因组序列，我们进行了额外的 RT-PCR 以扩增包含 5-9 个片段的全基因组并对 RT-PCR 产物进行测序。简而言之，根据从 NGS 获得的每种病毒的基因组序列，设计了 5-9 对特异性引物，相邻片段之间有 100-400 bp 的重叠。如上所述，对九个小牛粪便样本进行了初步处理，然后用QIAamp Viral RNA/DNA Mini Kit（QIAGEN，德国）提取病毒RNA。逆转录 (RT) 是使用 PrimeScript II 逆转录酶 的试剂按照制造商的方案进行的。随后进行 RT-PCR 以使用特定引物扩增每个 BoAstV 菌株的基因组直接测序。将带弱条带的片段克隆到pMD19-T载体中测序。通过对上述获得的片段序列进行组装，获得了9个BoAstV毒株的近乎完整的基因组序列。最后，将NGS获得的序列与Sanger测序获得的序列进行比对，以确定9个BoAstV毒株的完整基因组序列。
小优推荐

QIAamp MinElute Virus Spin Kit (50)   Cat. No. / ID: 57704
用于从血浆、血清和无细胞体液中同时纯化病毒 DNA 和 RNA
    洗脱液中的最大浓度以实现高下游灵敏度
    快速纯化高质量的病毒 DNA 和 RNA
    无有机萃取或醇沉
    一致的高产量
    去除污染物和抑制剂

QIAseq FastSelect –rRNA HMR kits

用于从人类、小鼠、大鼠和其他哺乳动物样本中快速去除 rRNA 和/或globin mRNA以制备 RNA-seq 文库
特点:
    与 QIAGEN、Illumina、NEB 和 KAPA 链 RNA-seq 文库试剂盒兼容
    用于人、小鼠、大鼠和其他哺乳动物物种的单一试剂
    仅需 14 分钟即可去除高性能 rRNA 和/或globin mRNA
    只需一个移液步骤——将 QIAseq FastSelect 试剂与 RNA 结合并孵育
    无需额外的清理步骤或 NGS文库流程更改
    也适用于FFPE和降解的RNA样本

整个去除只需将 QIAseq FastSelect 试剂（rRNA 去除和/或globin去除）添加到 RNA 样品中，进行片段化（如果需要），将反应从 75°C 逐步冷却至 25°C 14 分钟，然后完成剩余的文库制备步骤。QIAseq FastSelect 可在有或没有 RNA 片段化的情况下工作，提供使用来自 FFPE 样品或降解 RNA 样品的 RNA 或高质量 RNA 作为标准 RNA-seq 文库构建工作流程的一部分的灵活性。 除此之外，QIAGEN还提供了果蝇、酵母、线虫、植物、泛细菌的FastSelect核糖体去除试剂， 另外针对鱼以及HMR与泛细菌打包方案新品近期也会上市。

QIAseq FX DNA Library UDI Kit (24)  Cat. No. / ID: 180477

用于 Illumina 仪器的全酶全基因组和混合捕获文库制备，偏差最小
    简化的 2.5 小时工作流程，轻松实现自动化
    库的高复杂性和统一的覆盖范围最大限度地提高了可解释的数据
    独特的双索引 (UDI) 适配器可用于多路复用多达 384 个样品
    片段大小、输入量和批次大小可定制为任何测序实验
    20 pg –1 µg 的灵活 DNA 输入