高效基因筛选工具2——表观遗传siRNA定制文库的应用

siRNA筛选揭示与KSHV感染相关新的宿主表观遗传因子

   

哈喽，艾瑞万~

文库筛选系列软文第二弹来啦！
不知大家是否还记得之前我们聊到的去泛素化酶文库的筛选应用，很多客户都有来和我们咨询哦~
所以，小编今天又为大家带来了siRNA基因筛选文库其他应用方向的文献解析，话不多说，我们一起来康康吧~

这篇文章是2020年发表的一篇使用表观遗传siRNA定制文库，筛选揭示与KSHV感染相关新的宿主表观遗传因子，是利用基因调控文库筛选病原宿主相关因子的一个典型范例：

背景：
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）是一种致癌病毒，通过在各种细胞类型中交替进行潜伏期和裂解周期的活动，从而导致人类终生感染。潜伏的病毒 DNA 具有复杂的染色质结构，且该过程是在宿主表观遗传因子的调控下逐步建立起来的。因此，揭示裂解病毒基因如何通过表观遗传调控而受到抑制是了解 KSHV 感染发病机制的核心。
那么，问题来咯~
哪些因素会影响病毒的复制，且与病毒潜伏期直接相关呢？研究人员又是如何开展实验去探索KSHV裂解周期的宿主限制因子呢？

实验流程简介：
1、siRNA表观遗传定制文库筛选：
研究者使用定制的表观遗传siRNA文库（购自Dharmacon），靶向 392 个宿主表观遗传因子，在 SLK 细胞中进行了 siRNA 的筛选。并分析了哪些因素会影响病毒复制和转录激活因子（RTA）及潜伏期相关核抗原（LANA）的表达，这两者分别是病毒基因中与裂解性复制和潜伏期相关的重要因子。

筛选方法：反向转染筛选法
1）    用KSHV感染SLK细胞，作用2h后，消化细胞，收集细胞悬液
2）    将siRNA和转染试剂混合，形成转染复合物，阵列分布在48孔板中
3）    将收集的细胞悬液加至各孔中，作用60h后，收集细胞
4）    提取总的RNA，进行相应的RT-qPCR验证

结果：

图1. 392个基因siRNA敲低后，从高到低排列RTA, LANA的表达情况

图2. 筛选出10个表观遗传因子，这些基因siRNA的抑制不仅增加了即早病毒基因RTA的表达，而且还增加了早期 K2 和晚期 ORF25 裂解基因的表达

图3. WB水平上检测表观遗传因子 shRNA 的敲低虽没有诱导 LANA 表达，但都可以在潜伏感染的 BCBL1 中诱导裂解基因表达

 

图4. 免疫荧光分析还证实 GATAD2B、KDM2B 和 ETV6 的 shRNA 敲低增加了表达裂解病毒蛋白（K8 和 ORF6）的 BCBL1 细胞的数量

综上，KDM2B，NuRD (GATAD2B, CHD4, MBD3)和 Tip60-R (HDAC7, HDAC9, KAT5, ETV6, KAT5) 可以在很大程度上通过抑制 RTA 的表达来抑制 KSHV 的裂解周期。

结论与意义：
本文利用siRNA表观遗传定制文库的筛选揭示了几种新的宿主表观遗传因子，这些因子参与抑制裂解基因以促进 KSHV 潜伏期的建立和维持，它们可能是潜伏基因表达和/或潜伏期间病毒 DNA 维持的关键调节因子。由于表观遗传过程是高度可逆的，识别和表征表观遗传因子，可以控制和维持KSHV潜伏期，同时可以提供潜在的治疗方法，为阻止人类持续感染KSHV奠定基础。

值得注意的是，文献中使用的siRNA文库筛选产品为Dharmacon提供的定制文库系列产品。作者在Dharmacon表观遗传学预制库的基因列表（涵盖836个表观遗传相关基因）中，挑选了自己感兴趣的392个基因，进行了cherry-pick文库定制，生成了个人专属文库，进行相应的文库筛选工作。

Dharmacon cherry-pick文库定制促销规则：
凡订购同种属5个基因及以上，即可享受优惠价格，定制您的个人专属文库，另可赠送阴、阳性对照siRNA！低至4400元，即可开展您的文库筛选工作哦~！

定制规格	ON-TARGETplus siRNA
0.1nmol/单条，4条预混0.4nmol规格	220元/单条siRNA
0.25nmol/单条，4条预混1nmol规格	360元/单条siRNA
0.5nmol/单条，4条预混2nmol规格	435元/单条siRNA
1nmol/单条，4条预混4nmol规格	535元/单条siRNA
2nmol/单条，4条预混8nmol规格	645元/单条siRNA
赠送阴、阳性对照siRNA

当然，Dharmacon也有现成的预制库供您选择，提供人、小鼠的全基因组及各基因家族预制文库，提供最大的筛选灵活性，具体文库信息见下表：

siRNA文库范围	基因数（Human）	基因数（Mouse）
Genome 全基因组	~19000	~20000
Druggable Genome 成药基因组	7553	6457
Drug Targets 药物靶点	4786	5144
Protein Kinases 蛋白激酶	709	742
Epigenetics 表观遗传	836	/
GPCR G蛋白偶联受体	390	571
Ion Channels 离子通道	349	335
Phosphatases 磷酸酶	254	220
DNA Damage Response DNA损伤应答	240	/
Membrane Trafficking 膜运输	140	/
Cell Cycle Regulation 细胞周期调控	131	128
Cytokine Receptors 细胞因子受体	116	/
Tyrosine Kinases 酪氨酸激酶	88	/
Nuclear Receptor 细胞核受体	52	/
Ubiquitin Enzymes 泛素化酶文库包括：
Ubiquitin Conjugation Subset 1 - Cullins, E1, E2, HECT E3 Ligases	87	80
Ubiquitin Conjugation Subset 2 - F-box, SOCS box E3 Ligases	115	103
Ubiquitin Conjugation Subset 3 - RING finger and RING finger-like E3 Ligases	386	329
Deubiquitinating Enzymes 去泛素化酶	98	126