【罗工秘籍42】ball ball了：补偿微球-调补偿神器

补偿微球——让调补偿一键搞定的神器
做流式最难最麻烦的是什么？
很多人会说：调补偿。
是的，没错，补偿问题是我们传统多色流式不可避免的问题；
很多人因此不敢去尝试做多色流式，一般做个6色实验就不敢往上做了，白白浪费了一台几十上百万的多通道流式仪，也错过了发高分文章的机会。
那么我们来看看调补偿最常见的问题是什么呢？
Part 1
不会自动调补偿，需要自己手动一个一个去调，费时费力。

Part 2
想用Flowjo自动调补偿，结果很多通道要么识别不到阳性信号，要么计算得乱七八糟，最后还是需要进一步手动调补偿，还不一定调得好。

Part 3
细胞样本很少，只够实验管，多色实验的单染管细胞量不够做单染管。如一些珍贵的组织样本或体液：脑组织，肠道组织、肿瘤组织、灌洗液等。

Q：抗体的宿主亚型如何看？
A：进入抗体官网，看Isotype这些地方，如下图：宿主就是mouse, “k”就是kappa链的意思。

如果像上面右图这样的“λ”链的，就不能使用BD的补偿微球啦。

Q：补偿微球怎么使用？
A：非常简单，每个单染管都这样。BD的微球就是把阳性微球和阴性微球各挤一滴混匀，加入0.5ug左右的流式抗体室温避光孵育15min，用PBS洗涤重悬即可（转速250g, 5min，用500uL左右 PBS重悬）。（Thermo的通用型微球是单瓶的，挤一滴即可，其他操作同上。）需要注意的是使用之前都要将微球瓶子充分涡旋，避免微球沉底、挤出来的液滴里没有微球。

Q：关于上机如何调参数的问题？
A：要用空白细胞和微球交替上机调整电压参数，确保所调的荧光通道的电压参数同时适用于细胞样本和微球，优先考虑适用细胞。
细胞直径较大的，微球可以选择plus的。
 

那么问题来了，为什么有的时候用微球做不出来？是抗体有问题吗？还是微球有问题？
这个时候要排除以下几个问题：

1.    抗体的宿主来源是否与微球的反应种属匹配？例如：Rat anti-mouse的某抗体选用了anti-mouse的微球，这是不对的，我们应该选择的是anti-rat的微球。
2.    免疫Ig亚型是否不匹配？BD的微球主要反应的是Ig的Kappa链，如果是lamda链可能就不适合，反应不出来，例如上述Q里的CD25抗体，就是“λ”链的，这种可以选择Thermo的微球（货号：01-2222-42）做。
3.    死活染料用微球染不出来？微球主要应用于抗体单染；死活染料它不是抗体，当然染不出来啦。所以死活染料的单染我们一般用稍微处理一下的细胞做。
还有个小问题就是不管是不是胞内指标，用微球都不需要固定破膜的！
如上问题（包括电压参数等）都排除无误后，还做不出来，那可能真的是抗体问题了。

单染再做不好，知道该用什么了吧？