多色文献9：肝脏免疫微环境中的NK细胞分型

文章主题:  29-Color Flow Cytometry: Unraveling Human Liver NK Cell Repertoire Diversity 

摘要：

NK细胞是先天性淋巴细胞，最初被发现是能够杀死肿瘤细胞并随后被病毒感染的细胞。NK细胞介导细胞死亡的主要途径之一涉及诸如穿孔素 和颗粒酶的溶细胞分子的分泌，这使NK细胞在功能上与其适应性免疫系统的对应物细胞毒性T淋巴细胞（CTL）相关。但是，触发杀伤靶细胞 的机制在这两个谱系之间有根本性的不同。NK细胞使用多种生殖系编码的受体来执行与识别非自我相关的主要任务：肿瘤监测和病毒感染清 除。遗传和环境决定因素决定了这些受体的整体多样性。

NK细胞不仅存在于循环系统中，而且还存在于淋巴器官以及子宫和肝脏等非淋巴器官中。肝脏在调节全身动态平衡中起着重要作用具有动态 变化的微环境，它也高度富含免疫细胞，并具有独特的免疫成分：NK细胞是最丰富的细胞，占人类肝内淋巴细胞的30-40%,而在外周血中通常占10-15％。肝脏的微环境具有复杂的解剖结构，对于通过肠道-肝轴（gut-liver axis）维持对源自肠道的抗原（包括多种肠道微生物组） 的耐受性至关重要。

有鉴于此，对人类肝脏NK细胞进行详细的表型表征至关重要。肝脏NK细胞内部具有高度异质性，因此可以利用高维流式技术来揭示肝脏 NK细胞组成复杂性，作者设计了29色的以组织NK细胞为中心的流式检测方案，展示了其在肝脏、外周血和次级淋巴组织上应用的潜力，并且 与外周血NK细胞相比，对肝脏NK细胞的多样性进行了深度分析。 

试验设计思路:

（Human）Panel配色方案如下：

  

配色时充分考虑了以下因素：

（1）对方案里所用的每种抗体用量都进行滴定；

（2）应用适当的FMO和同型对照，以帮助排除荧光素聚集体并准确设置阳性门；

（3）荧光素亮度与抗原表达密度的强弱平衡搭配

（4）尽可能避免共表达标志物的荧光素光谱之间的高度重叠。

除死细胞标记（DCM）外，作者总共使用32种抗体来检测29种荧光参数。此方案重点关注与组织驻留相关的表面和胞内蛋白，以及描述NK细胞功能潜力的蛋白（激活和抑制受体、效应蛋白、激活和分化标志物、趋化和增殖），同时排除主要的髓系和B细胞（Lin channel：DCM、CD14、CD19、CD123）。

由于组织驻留不仅是NK细胞的特性，驻留T细胞也会表现出相似表型，因此我们将单独的荧光素分配给主要的T细胞亚群以便进行相关比较

肝脏富集的NK细胞群簇的降维和聚类分析