小优细节君-离子通道蛋白如何做好WB

引言 
2021年的诺奖颁发给了戴维·朱利叶斯和阿登·帕塔普蒂安，以表彰他们在“发现温度和触觉感受器”方面作出的贡献，主要是新的离子通道蛋白TRPV1和Piezo。之前的文章，小优跟大家一起回顾了两位大佬的发现之旅。其实，这是离子通道领域第三个诺奖。1991年，埃尔温·内尔以及伯特·萨克曼由于发明膜片箝电位记录技术，证实离子通道获奖。2003年，颁发给了发现水通道的彼得·阿格雷和利用X射线晶体成像技术展现离子通结构的罗德里克·麦金农。
 

图1 离子通道蛋白

离子通道蛋白的研究方法
针对离子通道的研究逐渐涉及许多科学技术，例如电生理学，免疫学，基因工程和影像学等。随着研究体系的发展，目前形成通过基因工程选择特定基因，构建文库，过表达或者敲除等方式进行筛选; 通过膜片钳技术观察电位变化；免疫学和影像学进行后续的蛋白结构、位置、表达水平的鉴定。其中免疫学中最常见的实验方法是免疫印迹（WB），但我们发现在用WB研究离子通道蛋白的过程中，经常结果不尽人意。鉴于离子通道蛋白的特性，要想WB一次成功，小优细节君整理了如下Tips，希望能够帮到您。

一、离子通道蛋白的主要特征：
1. 具有多重跨膜结构域
2. 分子量较大
3. 具有同源或异源多聚体
4. 结构复杂
 

图2 CaV2.1跨膜结构域

二、离子通道蛋白WB实验的注意事项
1、样品类型与蛋白特征
样品制备是任何蛋白质印迹 (WB) 中至关重要的第一步。您使用的制备方案取决于您计划使用的样品类型和蛋白特征。
对于细胞（贴壁/悬浮）样品，建议直接用Laemmli样品缓冲液，该方法将几乎所有细胞蛋白质释放到缓冲液中。如果后续要做IP，应该使用温和去垢剂（Triton X-100或者NP-40）制备细胞系。对于组织样品，例如，从心脏、脑组织和脂肪组织中提取相同蛋白质的最佳方法不一定是相同的。通常，可以同时尝试两种裂解方案，比如“富集膜蛋白”或“常规制备”，最后选择对目的蛋白最合适的方案。
此外，还需要考虑蛋白质的亚细胞定位（例如，质膜蛋白和核蛋白需要不同的样品制备方法），以及目标蛋白是否富含脂筏等特定微结构域（低温下脂筏能抵抗非离子去垢剂的抽提，超声有助于裂解过程）。当目的蛋白丰度很低时，还需要浓缩膜组分。蛋白具有多重跨膜结构域时，需要注意防止蛋白聚集或降解。

2、裂解液与裂解方式
对组织或细胞样品进行裂解是为了释放目的蛋白、不同裂解缓冲液对蛋白溶解能力各不相同。现在裂解液市面上有很多，有RIPA，NP-40，Triton X-100，SDS等，那我们如何去做选择呢。离子通道抗体厂家Alomone不建议使用RIPA进行裂解样品，RIPA往往会“破坏”膜蛋白，导致膜蛋白降解，特别不适合多重跨膜蛋白和易降解膜蛋白。另外，RIPA 裂解液提取蛋白已被证实有 10-30% 的蛋白会丢失在不可溶组分中。Laemmli样品缓冲液释放更加全面。有些蛋白对于降解非常敏感，可以尝试不同的样品裂解液。

          
在裂解组织蛋白时，请注意全程需在冰上操作，裂解时需加入cocktail形式的蛋白酶体抑制剂。对于核蛋白和富含脂筏的，裂解时强烈建议超声处理，可以更大程度释放蛋白。组织匀浆时，避免使用匀浆珠，后者的放热可能导致蛋白损失。裂解后测完浓度，冻存于-80℃备用。

3、变性与上样
变性时，将样品在 Laemmli 缓冲液中 70–100°C 下加热 10 分钟。对于细胞，通常将其加热到 100℃。组织是更复杂的样本，加热到 70℃可保护最“容易”降解的蛋白质。另外，对于多重跨膜蛋白，也不建议煮沸，可能会引起膜的聚集或者膜蛋白的降解，一般建议70℃ 10min或者37℃ 30min。对于可能形成多聚体的指标，要确保中Laemmli 缓冲液中的还原剂有效，最好新鲜配制，DTT长时间会失效，可另外补充。
如果样品在冰箱里存储一段时间，上样前可在70℃煮一下，有助于得到清晰的条带。细胞样品建议上样2–5x105 个细胞/泳道的裂解液。由于组织裂解时有许多杂质，上样 80–100 µg 组织裂解液/泳道。
 

图3 煮沸可能引起膜蛋白降解

4、电泳与转膜
对于高分子量蛋白(HMW，分子量>150KD)，电泳时Tris-Glycine 4–6% 或 Tris-Acetate 3–8% 凝胶是最佳选择，也可根据经验选择凝胶。
HMW建议湿转，在 4°C 下以 100 mA 将蛋白质从凝胶转移到膜上 20 小时。注意此步骤至关重要，因为它决定了传输的有效性。较长的转移时间将提高 HMW 蛋白质转移的效率。
5、封闭与抗体稀释
一般产品说明会提供对应抗体的最佳的实验条件，当您实验遇到问题，需要优化实验时，请您优先参照产品说明进行操作。

三、常用实验protocol:
1、使用 Laemmli 样品缓冲液制备细胞裂解液
a.用冰冷的 PBS 清洗细胞板。重复3次。(对于悬浮细胞，清洗离心后加入裂解液)
b.将板置于冰上并以 5 × 10 6细胞/ml 样品缓冲液的比例加入预冷的样品缓冲液（62.5 mM Tris (pH 6.8)、2% SDS、10% 甘油和 100 mM DTT）。
c. 用细胞刮刀刮下培养皿并将裂解液收集到微管中。
d. 将样品在 100°C 下煮沸 5 分钟。
e. 对煮沸的样品进行超声处理 5 秒钟。
f. 将样品在 4°C 下以 14,000 rpm 的速度离心 5 分钟。
g. 将上清液转移到干净的微管中，并储存在 -80°C 直至进一步使用。

2、使用温和去垢剂制备细胞裂解液
对于IP等应用，我们建议使用温和的去垢剂（如 Triton X-100 或 NP-40）进行细胞裂解。
a.用冰冷的 PBS 清洗细胞板。重复3次。(对于悬浮细胞，清洗离心后加入裂解液)
b.将板置于冰上并以 5 × 10 6 个细胞/ml 的比例加入预冷的IP裂解液。
c.用细胞刮刀刮下培养皿并将裂解液收集到微管中。
d.在 4°C 下将样品在微管中摇晃 30 分钟。
e.将样品在 4°C 下以 14,000 rpm 的速度离心 10 分钟。
f.小心地将透明上清液转移到干净的微管中。您可以将样品在 -20°C 下保存数月或立即与 Laemmli 样品缓冲液混合。

3、富集膜蛋白制备组织裂解液
a.从动物身上取出感兴趣的组织，并在液氮中快速冷冻。将组织储存在 -80°C 直至进一步使用。
b.将冷冻组织放入 5倍体积预冷的富集膜蛋白裂解液中。。
c. 用 polytron 匀浆器匀浆组织。
d. 在 4°C 下以 2,000 x g离心匀浆 10 分钟。丢弃大碎片。
e. 将上清液转移到干净的微管中，将沉淀重悬在 2 体积的富集膜蛋白裂解液中并重新匀浆。
f. 在 4°C 下以 2,000 x g离心匀浆 10 分钟。将上清液与步骤 e中的上清液混合。
g. 将上清液（来自步骤 e 和 f）在 4°C 下以 100,000 x g离心 1 小时。
h. 丢弃上清液。用 2 倍体积的富集膜蛋白裂解液重悬沉淀（含有组织膜），并用 polytron 匀浆器短暂匀浆。
i. 使用 Bradford 方法测量蛋白质浓度。用富集膜蛋白裂解液将蛋白质浓度调整至 4 mg/ml。
j. 将蛋白质样品储存在 -80°C 直至进一步使用。

4、常规制备组织裂解液
a.    从动物身上取出感兴趣的组织/器官，并在液氮中快速冷冻。将组织/器官储存在 -80°C 直至进一步使用。
b.    将冷冻组织放入5倍体积预冷的常规组织裂解液中。
c. 用 polytron 匀浆器匀浆组织。
d. 在 4°C 下旋转样品 30 分钟。
e. 在 4°C 下以 100,000 x g离心匀浆 1 小时。
f. 将上清液转移到干净的管子中，并使用 Bradford 方法测量蛋白质浓度。使用常规组织裂解液将蛋白质浓度调整至 4 mg/ml。将裂解液储存在 -80°C 下直至进一步使用。

好的研究依赖于稳定高质量的试剂， Alomone离子通道专家（优宁维独家代理）多年来一直为离子通道研究提供稳定可靠的抗体,小分子化合物等。除了试剂,离子通道研究另一个不可或缺的工具就是—全自动膜片钳。

Reference
1.Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature 1997:389:816-824.
2.McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 2002:416:52-58
3.Coste B, Mathur J, Schmidt M, Earley TJ, Ranade S, Petrus MJ, Dubin AE, Patapoutian A. Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels. Science 2010:330: 55-60
4. Janes, K. A. (2016). An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
5. https://www.alomone.com/support/protocols