玩儿转RNAi——Accell siRNA多功能应用展示

上一期我们谈到了最简单的RNAi——Accell siRNA，也介绍了产品的一些基本属性，很多家人们对Accell siRNA充满了兴趣，想进一步了解Accell siRNA的实际应用情况。
这不，本期优宁维分子君带着应用文献“Buff”加持来咯，全方面展示 Accell siRNA的多功能应用情况。

1.    in vitro——难转染神经细胞应用
 
背景：Spry2和PTEN是公认的受体酪氨酸激酶 (RTK) 信号传导调节剂，Spry2 或 PTEN 的敲低可增强背根神经节 (DRG) 神经元的轴突再生。为了比较同时敲低Spry2和PTEN或单一敲低其中之一的促轴突伸长作用效果，作者使用了PTEN- Accell siRNA进行体外DRG（Spry2-/- ；Spry2+/- ）的双敲低验证。
方法：
1）    DRG神经元的分离培养：选取野生型小鼠，纯合型Spry2-/-、杂合型Spry2+/-基因敲除小鼠，分离相应的DRG，经洗涤和机械分离形成神经节，最终通过离心重悬形成原代神经细胞；
2）    原代神经细胞的转染：
a.    选用Accell siRNA进行对照组（Accell non-targeting siRNA pool）和实验组（Accell mouse PTEN SMARTpool siRNA mixture）的转染;
b.    原代神经细胞贴壁生长2h后，使用终浓度为1uM的Accell siRNA搭配使用Accell siRNA delivery media进行转染；
c.    分别在转染24h, 48h, 72h后进行检测；
3）    qPCR、免疫组化、轴突生长分析、WB验证等。
结果：Accell siRNA无需转染试剂的递送系统，更适合于原代神经细胞的转染优化，一定程度上更好地敲低PTEN。结果也表明，较单一敲低PTEN，同时敲低Spry2和PTEN在轴突伸长中有更强的影响力，联合治疗方法可能更有助于改善神经再生。
 

2.    ex vivo——活体外肺切片应用
 
背景：特发性肺纤维化 (IPF) 是一种慢性疾病，为了找到合适的药物靶点，作者使用Accell siRNA沉默活体外肺切片中Serpinh1基因编码的热激蛋白47（HSP47），从而评估Serpinh1基因作为药物靶点的可能性。
方法：
1）    活体外肺切片的制备与培养：每个Slice重4~5mg，厚度为250~350um，直径为5mm；每个切片单独置于12孔板中，每48h更换培养基；
2）    增强肺切片的纤维发生：在培养基中添加5ng/mL TGFβ1；
3）    Accell siRNA沉默：分别使用终浓度为0.5uM的Serpinh1-targeting Accell siRNA和对照Accell siRNA进行转染；
4）    mRNA水平表达量检测：作用96h后，提取RNA进行qPCR的检测；
5）    蛋白水平表达量检测：作用144h后，进行WB验证。
结果：Accell siRNA转染后，Serpinh1基因mRNA表达量下降了65%，HSP47蛋白表达量下降了90%，该过程并未影响肺切片的活力和形态。且沉默Serpinh1基因后，只观察到纤维连接蛋白分泌量减少，其他纤维生成不受影响。这表明Serpinh1-targeting Accell siRNA有效的抑制了小鼠的肺纤维化，增加了Serpinh1基因作为药物靶点的可能性。
 
Accell siRNA在肺切片中的工作流程

3.    in vivo——活体内角膜基质注射应用
 
背景：这篇文章中Accell siRNA作为一个前期验证，为作者下游实验奠定基础。角膜营养不良作为染色体显型疾病，非常适合使用小干扰 RNA (siRNA) 进行等位基因特异性基因沉默。通过注射递送至角膜的 siRNA 虽然有效，但不适合频繁的长期治疗方案。作者为了验证他们创新性的局部应用替代方案，首先使用Accell siRNA分别进行角膜基质的递送和局部表面应用的对比。
方法：
1）    角膜基质内注射Accell siRNA：分别使用Accell control (Accell-NSC4) ，luc2 siRNAs (Accell-siLuc) 进行小鼠角膜基质内注射（每只小鼠每个眼睛角膜基质内注射量：150pmol/ul, 2ul），利用小动物活体成像仪观察角膜上皮荧光素酶表达情况，观察时间为7天；
2）    局部表面应用Accell siRNA：方法同上。
结果：角膜基质内注射Accell siRNA能够有效地抑制体内荧光素酶的表达，且在72h后达到大于50%的沉默效果，在第5天可以达到最高沉默效果（64%），且总的沉默效果可持续6天。与之相反，局部表面应用Accell siRNA，荧光素酶表达没有显著下降，基本没有被敲低。因此，凭借这个结果，作者认为siRNA在小鼠眼部局部给药应用中存在局限，为了找到更好的局部给药方式，作者展开了一系列的实验验证。Accell siRNA在这篇文献中起关键性引导作用。
 

讲座预告：
软文篇幅有限，分子君仅挑选了几篇代表性的文章进行展示，其实Accell siRNA的应用远不局限于此，感兴趣的小伙伴们可持续锁定优宁维小优博士：1月25日下午4点Accell siRNA应用专题讲座，届时我们可以一起线上探讨Accell siRNA的产品性能、使用方式等，更多Accell siRNA延伸应用，敬请期待~！

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