均相检测技术助力IAP抑制剂筛选

细胞凋亡是抗肿瘤药物重要的研发方向之一。细胞凋亡抑制蛋白（IAP，Inhibitor of  Apoptosis）能够抑制细胞内凋亡作用。近年来，研究者在多种肿瘤中发现了IAP的失调，且IAP蛋白的高表达促进了肿瘤发生和肿瘤转移，包括肺癌、头颈癌、乳腺癌、胃肠癌，以及黑色素瘤和多发性骨髓瘤等。因此，IAPs的抑制剂是抗肿瘤药物研发的重要方向。IAPs家族有8个成员，分别是NAIP，cIAP1，cIAP2，XIAP，Survivin，Apolon，ML-IAP和ILP2。它们具有调节胞外信号激酶的活化、细胞黏附、细胞迁移及抗肿瘤等作用。

cIAP1，cIAP2和XIAP是IAP家族的主要成员，cIAP1和cIAP2的结构和功能非常相似。XIAP可以结合诸如caspase-3、caspase-7、caspase-9等关键的促凋亡节点。其他成员诸如cIAP1、cIAP2则是通过调控NF-κB信号通路中的某些关键蛋白的泛素化状态，实现对整个凋亡通路的调控。

此外，2020年发表在Blood 杂志上的一篇论文指出，包括birinapant、LCL-161在内的SMAC模拟物可作为CAR-T细胞杀伤能力增强剂。
 
IAP抑制剂可分为SMAC模拟物和非肽类小分子两类，其中SMAC模拟物可依据结合位点的数目分为单体和二聚体抑制剂，单体抑制剂能与XIAP、cIAP1、cIAP2结合，激活Caspase-9活性，解除IAP对Caspase的抑制作用；二聚体抑制剂可激活Caspase-3/7/9的活性，达到促进细胞凋亡的目的。

尽管全球领域针对IAP蛋白靶点尚无获批药物，但相关管线正在开发进程中。随着当前的研究推进，IAP小分子抑制剂在抗癌领域的前景非常值得期待。

均相检测技术的优势有哪些？

无需洗板和包被，省时省力 
窗口大，灵敏度高              
操作简单，空板加样即可检测
节省样本，适合珍贵样本                          
实验背景低
适用于96、384和1536孔板
酶标仪即可检测

那么，均相检测技术在IAP抑制剂筛选中能做什么呢？小编分别从HTRF技术和AlphaLISA技术进行介绍。

一、HTRF技术如何检测呢？

竞争法检测，下面以HTRF Human cIAP1 BIR2 Binding Kit为例。

Tb标记抗GST标签（cIAP1 BIR2带GST标签）的抗体作为荧光能量的供体，d2标记的能够结合生物素化的LCL161 cIAP1的链霉亲和素作为荧光能量的受体。当荧光能量的供体和受体相互接近时，用光源（激光或闪光灯）激发供体，会触发向受体方向的荧光共振能量转移(FRET)，进而在特定波长（665nm）发出荧光。待测化合物与生物素化的LCL161发生竞争，从而阻断FRET的发生，使得原有的高信号下降。信号值与化合物的浓度成反比。

检测流程看这里→依次加入5μl待测物，5μl标签蛋白和10μl检测试剂（总体系20μl），孵育2小时使用酶标仪读板即可。实验全程无需洗板和包被。实验结果IC50值为4.1μM。（酶标仪需支持HTRF模块）
 

二、AlphaLISA技术如何检测呢？

AlphaLISA同样采用竞争法进行检测，以AlphaLISA Human XIAP BIR3 Binding Kit为例。

使用谷胱甘肽包被的供体微珠捕获带GST标签的XIAP BIR3蛋白，链霉亲和素包被的受体微珠捕获生物素化的配体。当供体微珠和受体微珠通过配体与XIAP BIR3蛋白结合而靠近。使用激光（680nm）激发时，供体微珠表面光敏剂与周围环境中氧发生反应，释放单线态氧扩散至受体微珠，产生615nm波长的光信号。当待检测物加入后，与体系中GST标签蛋白相结合，从而信号降低，信号值与反应浓度成反比。
 
实验流程→微孔板内依次加入5μl待测物，5μl标签蛋白，5μl生物素化配体和5μl检测试剂混合物，孵育2小时后进行读板即可。仍然是无需洗板和包被，轻松搞定。（酶标仪需支持Alpha模块）
实验结果显示如下图：

图A：标准曲线得出IC50为40nM。
图B：使用SM164，LCL161，GDC-0152，A140099.1 and BRD4 SNIPER待测物绘制出抑制曲线，IC50值分别为0.6, 41, 49, 33, and 712nM。无关化合物Thalidomide（Cereblon E3Ligase ligand)未呈现竞争反应。证明特异性高。
 
相关产品推荐

HTRF检测试剂盒
货号	产品名称	规格
64BDIAPB2PEG	HTRF Human cIAP1 BIR2 Binding Kit	500 tests
64BDIAPB2PEH		10,000 tests
64BDIAPB3PEG	HTRF Human cIAP1 BIR3 Binding Kit	500 tests
64BDIAPB3PEH		10,000 tests
64XIAPB2PEG	HTRF Human XIAP BIR2 Binding Kit	500 tests
64XIAPB2PEH		10,000 tests
64XIAPB3PEG	HTRF Human XIAP BIR3 Binding Kit	500 tests
64XIAPB3PEH		10,000 tests
AlphaLISA检测试剂盒
货号	产品名称	规格
AL3166C	AlphaLISA Human cIAP1 BIR2 Binding Kit	500 Assay
AL3166F		5,000 Assay
AL3167C	AlphaLISA Human cIAP1 BIR3 Binding Kit	500 Assay
AL3167F		5,000 Assay
AL3172C	AlphaLISA Human XIAP BIR2 Binding Kit	500 Assay
AL3172F		5,000 Assay
AL3173C	AlphaLISA Human XIAP BIR3 Binding Kit	500 Assay
AL3173F		5,000 Assay
酶标仪
HH35000500	PerkinElmer VICTOR Nivo