【罗工流式宝典第4式】小鼠骨髓来源树突细胞的获取，体外诱导及相关功能评价

树突状细胞(DC)是先天免疫系统不可分割的组成部分，在免疫激活中发挥着重要的作用。在哺乳动物的免疫系统中，至少有两类树突状细胞，髓系树突状细胞（cDC）和浆细胞样树突状细胞(pDC)。另外，DC也可以分化为耐受性树突状细胞（TolDC），其具有稳定、半成熟表型和耐受性等属性，可以消除免疫反应，限制T细胞的免疫发生，以维持和促进T细胞的耐受性。TolDC疗法被认为是多项临床试验中自身免疫性或慢性炎症性疾病治疗的替代或辅助方法。

本文提供一个详细的骨髓来源DC细胞的获取，诱导细胞分化为TolDC以及相关功能评价的方法。

图1：DC细胞的耐受机制

实验前准备

小鼠骨髓 单细胞悬液制备	体外诱导	BMDC细胞检测
1. 70%酒精 2. 手术刀、镊子、注射器，培养皿 3. 红细胞裂解液，PBS 4. 锥形管、滤器 5. 台酚蓝、细胞计数仪	1. 细胞诱导因子：GM-CSF，IL-4 2. 6孔板 3. 培养基、血清等	1.      流式荧光抗体 2.      FACS缓冲液 3.      Elisa 4.      qpcr

一、 原代骨髓单细胞悬液制备

1.      通过高压灭菌消毒所有手术器械，在二类生物安全柜中，采用适当的安全程序进行实验。

2.      使用CO2对8-10周龄的C57BL/6小鼠实施安乐死,将小鼠放在解剖板上，用70%的乙醇冲洗,用手术剪刀切除胫骨-腓骨和股骨，置于有70%乙醇的10厘米培养皿中。

3.      用手术刀片和镊子剔除组织，分离胫骨和股骨，置于有70%乙醇的6cm培养皿中。

4.      使用手术刀片来修剪胫骨和股骨的两端。用装有3mLPBS的23G针头的注射器，将骨髓内容物从骨的一端冲洗到含有12mlPBS的锥形管中。骨骼每端重复3次。

5.      将细胞悬液以300xg离心5min。

6.      弃上清，加1ml红细胞裂解液重悬细胞，裂解5min，去除红细胞。

7.      加9mlPBS，300xg离心5min。

8.      弃上清，用10ml培养基(RPMI-1640+L-谷氨酰胺、10% FBS、1%非必需氨基酸、10mM HEPES、50 nM β-巯基乙醇和5%青霉素/链霉素)重悬。

注：FBS中的内毒素水平必须小于0.1EU/ml。

9.      将细胞悬液用40μm滤器过滤，取20µl细胞悬液，与80µl台盼蓝混合，细胞仪计数活细胞数量。

二、 体外诱导骨髓，获取BMDC

1.      用含15ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的培养基，将细胞数调整为1x106个细胞/ml。

2.      6孔板铺板，每孔3ml1x106个细胞/ml，在37°C、5%CO2、95%湿度的CO2培养箱中孵育

注：一只小鼠的骨髓细胞约为3-5x107细胞，即可以铺2到3 个6孔板。

3.      培养第3天，去除孔中培养基，每孔中加入2ml新鲜PBS，然后轻轻旋转平板，确保去除所有非贴壁细胞。

4.      每孔加入3ml含15ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的新鲜培养基继续培养。

5.      培养第5天，每孔再加入3ml含15ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-4的新鲜培养基继续培养。

注：此时每孔体积为6ml。

6.      培养第7天，将整个板子放在冰上10min。用移液器轻轻的吸去培养基，从而得到松散粘附的BMDC，视为未成熟DC（iDC）。

注意：粘附的巨噬细胞仍附着在培养皿上。低温和温和的步骤是避免DC细胞激活，从而影响进一步实验的关键。

7.      将细胞悬液300xg离心5min，用新鲜培养基重悬，等待进一步实验。

注：通过流式细胞术，用荧光标记的CD11c抗体来鉴定BMDC的诱导效果

图2：BMDC的分化过程和表型特征鉴定

三、 TolDC的体外诱导及鉴定

1. 在6孔板中，每孔加入2ml 含100-400 nM CDDO-DFPA的培养基，1x106 /ml的BMDC，培养箱中孵育1h。

注：CDDO-DFPA是一种合成的三萜类药物，也可以用其他已知药物将iDC中诱导成TolDC，如IL-10、维生素D3、地塞米松或BAY11-7085。

2. 加入10或100ng/ml的LPS，孵育4-24h，诱导成熟mDC(孵育时间因mRNA或蛋白质测定而不同)。

3. 用1ml移液管轻轻收集细胞悬液。300xg离心5min，分别收集细胞和上清液。

4. 流式分析细胞表面抗原（如刺激抗原：CD40、CD80、CD86、MHC-II、OX40L、ICOSL，或抑制性抗原：PD-L1、PD-L2、ILT3、ILT4）。

5. 提取RNA进行qRT-PCR检测，CBA多因子检测分析上清样本中的细胞因子（如炎症细胞因子：TNF-α、IFNγ、IL-6、IL-12和IL-23，或抗炎细胞因子：IL-4、IL-10、IL-15、TGF-β1）。

DC表面标记

图3：DC部分表面蛋白表达结果

四、TolDC的体外功能评价

1.    通过磁珠分选得到小鼠脾脏来源的CD4 +T细胞。

2.    用1μM CFSE标记CD4+T细胞(1x107/ml)15分钟，用PBS洗涤，调整终浓度为2x106T细胞/ml。

3.    96孔板中，用100μl（2x105 /ml）TolDC与相同体积的CFSE标记CD4+T细胞共培养（即最终数量比为1:10），每孔加入100ng/mL卵清蛋白肽(323-329)，在孵育2-3天后，通过流式细胞术检测T细胞的CFSE强度。

注：卵清蛋白肽(323-329)代表 OVA 的 T 和 B 细胞表位，引起小鼠的即时超敏反应

图4：TolDC对T细胞的增殖抑制（w/—with;w/o—without）

[1]  Wei H.J., Letterio J.J., Pareek T.K. Development and functional characterization of murine

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