骨髓间充质干细胞（MSC）的分离，扩增及表型鉴定

间充质干细胞或间充质基质细胞（MSC）是可以从各种来源（包括骨髓，脂肪组织或脐带）分离的体细胞或成体干细胞。分离的MSC是表现出位点特异性分化的成纤维细胞样细胞。MSC可能在体内再生受损或患病的组织，并可能在免疫调节中发挥作用，这为各种临床应用提供了基础。

1:缓冲液准备

1.1 PE（PBS+EDTA）缓冲液，用于分离单核细胞
用磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2和2mM EDTA制备溶液。低温（2–8°C）保存。
▲注意：EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸葡萄糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。

1.2 PBE(PBS+BSA+EDTA)缓冲液，用于分离CD271 +细胞。
准备包含磷酸盐缓冲盐水（PBS）的溶液，用autoMACS®冲洗溶液以1:20的比例稀释MACS®BSA储备溶液，可得到pH 7.2、0.5％的牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA。低温（2-8°C）存放。
▲注意：EDTA可以用其他补充剂代替，例如抗凝柠檬酸葡萄糖配方A（ACD-A）或柠檬酸磷酸葡萄糖（CPD）。 BSA可以用其他蛋白质代替，例如相应的血清白蛋白，相应的血清或胎牛血清（FBS）。不建议使用含有Ca2 +或Mg2 +的缓冲液或培养基。

2：分选单核细胞

2.1 梯度密度离心

2.2 人骨髓单个核细胞(BM MNCs)的制备
▲注意：仅使用新鲜骨髓。避免冷冻和解冻骨髓细胞，并在无菌条件下进行。
1.用针头从髂骨上嵴或胸骨采集骨髓。
2.用缓冲液以7：1的比例稀释抽吸的人骨髓，例：用5mL缓冲液稀释30mL的骨髓，最终体积为35mL。
3. 100µm过滤器过滤，去除骨碎片和细胞团。（▲注：使用前，先用缓冲液的润洗滤器。）
4.将35ml稀释的细胞悬浮液与15ml的Ficoll-Paque混合于50ml圆锥形瓶中。
5. 445g，20°C，离心35min。
6．除去上清，吸取BM MNCs ,至新的50ml圆锥形瓶中。
7．加入40ml缓冲液洗涤细胞，在20°C 300g离心10min，弃上清液。
8. 为去除血小板，将细胞颗粒重新悬浮在50mL缓冲液中， 20°C ，200×g离心10-15min，弃上清液。
9. 将细胞颗粒重新悬浮在适量的缓冲液中，以供下游应用。
▲注：骨髓单个核细胞可以在含有0.5%牛血清白蛋白或自体血清的PBS中保存过夜。细胞在冰箱中保存的时间不要超过一天。在进行磁性标记之前至少清洗一次，并将细胞重新悬浮在适当的缓冲液中。

3.MSCs定量分析
推荐使用MSC Enumeration Kit, huma（130-106-646）试剂盒。

3.1荧光标记
1．准备2支流式管分别为A管(control sample) B管(MSC sample). 分别加入100ul 骨髓样本。
2．每个试管中加入20µL FCR封闭，冰上暗孵育30min。
3. 抗体加入设计如下：

4. 每管加入10ul 7-AAD 上机检测。
5．结果展示

4.磁珠分选CD271
骨髓来源的人MSC可以通过特定的表面标记（例如CD271）进行分离。推荐使用美天旎使用human CD271 MicroBead KIT(130-099-023)分离MSC。
1：在LS或MS分选柱上放置一个预分离过滤器（30 µm）。
2：用PBE缓冲液冲洗色谱柱3次，确保过滤器已预先润湿。
3：将细胞悬液和PBE缓冲液加到柱上的过滤器上
4: 进行磁性分选。

5.MSCs 的扩增
使用StemMACS MSC Expansion Media Kit XF (130-104-182)扩增分离的human MSC，这是一种经过优化和标准化的完全培养基，可从骨髓和其他组织来源再生和扩增MSC。

5.1 StemMACS MSC Expansion Media Kit XF 保持MSC良好的增殖能力。

A: 在StemMACS MSC扩展培养基XF中培养的MSC表现出更高的克隆潜力
B: 与在αMEM+ 5％血小板裂解液中或在含有10％胎牛血清（FCS）的培养基中培养的MSC相比的增殖效率。

5.2扩增的MSC非常适合进行免疫调节

扩增的MSC非常适合进行免疫调节。分离的MSC在StemMACS MSC扩展培养基XF或αMEM+ 5％血小板裂解液中扩增。使用MSC Suppression Inspector通过与MSC共培养的反应性T（Tresp）细胞的细胞增殖来测量免疫调节。在该增殖测定中，用荧光染料将Tresp细胞的质膜染色。随着Tresp细胞的每次分裂，染料被越来越多地稀释。因此，MFI的降低表明Tresp细胞的增殖率很高。在多克隆刺激下，仅Tresp细胞显示出强烈的增殖反应。 MSC与Tresp细胞的共培养导致Tresp细胞的增殖减少。在StemMACS MSC扩展培养基XF中培养的MSC的存在将Tresp细胞增殖抑制到非刺激的Tresp细胞水平。

5.3 保持分化潜能

使用StemMACS MSC Diff培养基，将在StemMACS MSC扩展培养基XF中培养的人MSC分化为成骨（A），成脂（B）或成软骨（C）谱系。在StemMACS MSC扩展培养基XF中培养的细胞具有广泛的分化潜力。

6．MSC表型验证。
现在科研工作者对MSC进行临床研究的兴趣日益浓厚，因此需要对将其分化为特定细胞类型的机制和过程进行基本了解，并需要对培养细胞进行MSC表型验证。人体MSC表型鉴定试剂盒基于人MSC的ISCT（国际细胞疗法学会）标记，可通过流式细胞术轻松地对培养扩增的MSC进行标准化表型分析。

而BD公司提供的MSC Analysis Kit multicolor phenotyping of MSC expansions
多色流式试剂盒能够鉴定该能功能。

7．MSC功能分析

7.1分化潜能
分化潜能是鉴定和定义MSC群体的有意义的工具。分化为脂肪细胞，软骨细胞和成骨细胞的程度受MSC来源的影响，因此，例如，相比于来自脐带的MSC，来自骨髓的MSC具有更大的分化成成骨细胞的潜力。供体年龄的增加和培养的MSC的传代也降低了分化潜能。
StemMACS™AdipoDiff，OsteoDiff和ChondroDiff培养基是人的最佳分化培养基，适用于从各种组织来源分离的人MSC。每种培养基均支持扩展的MSC的分化能力分析或质量控制，以及MSC分化过程的体外研究，包括基因表达和蛋白质谱分析。推荐产品：StemMACS AdipoDiff Media human（130-091-677）；StemMACS OsteoDiff Media human（130-091-678）；StemMACS ChondroDiff Media human（130-091-679）

7.2 免疫调节潜能
在过去的几年中，科学家将注意力集中在了MSC的免疫调节潜力上。已观察到源自骨髓的MSC抑制T细胞增殖。可以使用人MSC Suppression Inspector（人类）抑制MSC的这种功能，其中包含针对MSC抑制测定而优化的T细胞刺激试剂。推荐产品：MSC Suppression Inspector human（130-096-207）

8 文献分享
1. Di Nicola, M. et al. (2002) Blood 99: 3838–3843.
2. Bartholomew, A. et al. (2002) Exp. Hematol. 30: 42–48.