外泌体#4：外泌体载药方式大合集

哈喽哈喽，这期又是杨小刀的主场哦。3月29日下午4点的外泌体讲座，你是不是没有来？
 
小刀知道你们忙、你们没时间、你们有事耽误了。没关系、不要紧、不碍事，小刀这不又来了嘛。
 
因为实在不想你们错过这些干货，所以特意又在讲座结束后，把讲座中的精华部分进行总结。没时间听讲座的宝宝们可以简单浏览以下内容，获取你想要的外泌体载药相关讯息。

目前有近20%的外泌体相关课题集中在外泌体作为药物载体方面的研究，从已发表的相关文章来看，研究主要集中在外泌体的载药类型和载药方式上：

一、    外泌体的载药类型主要分为三大类：药物分子、核酸和蛋白。

 
J Control Release. 2017 Sep 28;262:247-258.

1. 药物递送系统：doxorubicin, paclitaxel, curcumin, temozolomide
2. 核酸递送系统：siRNA, miRNA, mRNA, DNA plasmid
3. 蛋白递送系统：catalases

二、    外泌体的载药方式：

 
J Control Release. 2017 Sep 28;262:247-258.

1.    Pre-loading: 内源性装载。在生物发生过程中，亲本细胞产生外泌体之前，就可以把治疗分子在外泌体生成过程中整合到外泌体内。让细胞成为我们载药外泌体的活工厂，直接生成我们想要的外泌体。

为了让大家进一步了解内源性外泌体装载的机制，小刀为大家精心挑选了三篇文献：

1）    Effects of exosome-mediated delivery of myostatin propeptide on functional recovery of mdx mice (Biomaterials. 2020 Apr;236:119826)
作者为了检测外泌体作为前肽递送载体的可行性，进行了以下相关实验：
构建编码前肽抑制域的融合蛋白，将其插入至外泌体跨膜CD63的第二细胞外环当中，使得前肽可表达在外泌体的表面
转导表达前肽的慢病毒（CD63-propeptide-expressing lentivirus）进小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3），生成表达前肽的外泌体（EXOpro）
小鼠腹腔注射EXOpro，表达前肽的外泌体能够特异性的与野生型小鼠血清中成熟的肌生成抑制素相结合，从而发挥相应的治疗作用
 

前肽表达载体构建示意图

2)    Exosome-based delivery of super-repressor IκBα relieves sepsis-associated organ damage and mortality (Sci Adv. 2020 Apr; 6(15): eaaz6980.)
EXPLOR系统：装载蛋白的外泌体通过光可逆系统进行蛋白-蛋白互作（该系统早在Nat Commun. 2016 Jul 22;7:12277 有过发表）
设计两种蛋白表达载体，构建可以稳定表达CIBN-EGFP-CD9 和srIκB-mCherry-CRY2两种重组蛋白的细胞株
利用460nm的蓝光照射，诱导细胞主动将抗炎性蛋白装载至外泌体中，从而进行可控的蛋白互作
EXPLOR系统优势：可轻松携带需要的重组蛋白，不需分离纯化；经基因改造的细胞可简单便捷的生产目的外泌体，在外泌体蛋白治疗商业化中有巨大潜力；可与个性化治疗兼容，生产根据患者定制的药物递送系统，从而减少宿主免疫反应
 

生成Exo- IκBα的质粒载体结构图；融合蛋白及其活性示意图

3)    In vivo self-assembled small RNAs as a new generation of RNAi therapeutics (Cell Res. 2021 Jun; 31(6): 631–648.)
基于体内自组装外泌体siRNA的策略，实现了siRNA从表达到装载再到递送的全体内自动化过程
体外构建可表达siRNA的基因环路，灵活的实现多个siRNA和靶向肽段的插入
核心环路：不带靶向标签，用于系统性siRNA的递送
自组装环路：带靶向标签，用于靶向性siRNA的递送
可编辑基因环路的优势：利用宿主自身器官分泌的外泌体作为载体，解决了siRNA递送载体带来的免疫源性和毒性问题；对基因环路的灵活编辑，可同时传输多个siRNA，对疾病进行多靶点打击；特异性的靶向肽段可高效的将siRNA输送到特定的组织，克服血脑屏障等生物屏障的制约

 
基因环路结构构建示意图

2.    post-loading: 外源性装载。

在分离天然外泌体后，对收集到的外泌体进行相应的药物装载，分为多种不同的装载方式：

装载方式	影响装载效率的因素	优势	劣势	适用类型
直接共孵育	药物的疏水性	简单易操作	低装载效率	小分子疏水性化合物
	“货物”的分子大小
	“货物的电荷”
超声处理	超声设备	高效装载效率	引起外泌体的重组/变形，破坏外泌体的完整性	亲水性药物分子或较大的蛋白
	超声强度、持续时间和周期
电穿孔	电压、电脉冲	高效装载效率	引起核酸物质的堆积	核酸、化合物
	电穿孔缓冲液
	电极材料
冻融	冻融循环数	中等装载效率	外泌体的聚集	化合物
	温度，pH值
挤压	挤压膜	高效装载效率	改变外泌体完整性	化合物
透化作用	透化器	高效装载效率	血细胞溶血作用	大分子蛋白

外泌体作为药物载体虽有诸多优势，但仍存在不少挑战，比如说外泌体的纯度和质量，外泌体的产量，外泌体的最佳储存条件等。目前的技术条件还是相当有限，亟待更新的技术去克服这些困难。

外泌体好物推荐：

货号	品名	适用样本	上样量	应用
76064	exoEasy Maxi Kit (20)	血浆 血清 脑脊液	1-4 ml	只提取外泌体
		细胞培养上清	8-32 ml
77164-Qiagen	exoRNeasy Maxi Kit (50)	血浆 血清 脑脊液	1-4 ml	提取外泌体以及外泌体中的总RNA
		细胞培养上清	32 ml
		尿液	16 ml
abs993-50mL	无外泌体胎牛血清	/	/	细胞培养

今天小刀的分享到此结束，欲知后续外泌体进展如何，请继续关注下周外泌体的讲座，下一期由鲁大师为大家带来：中国人不骗中国人，外泌体美容大揭秘！平时关注美容、爱美的宝宝们千万别错过啦，我们与大家不见不散呦！