均相技术来帮忙——建立非洲猪瘟AlphaLISA检测方法

非洲猪瘟(ASF)是一种急性、高传染性和致命的野猪出血性疾病，在没有明显临床症状的情况下，可在几天内导致猪急性死亡。ASF于1921年首次在肯尼亚首次被发现，然后传播到世界许多地区，包括非洲、欧洲、俄罗斯联邦、南美和加勒比地区，造成了巨大的经济损失。自中国首次确诊的ASF疫情以来，已在32个省发现了180多次ASF疫情。

非洲猪瘟病毒(ASFV)是ASF的病原体，ASFV的基因组范围在170~190kb之间，共注释了151个基因。在这些基因中，B646L是用于大规模评估ASFV遗传多样性的第一个遗传靶点之一，主要编码衣壳蛋白p72。p72是ASFV自然感染的主要免疫原，是设计ASFV免疫诊断试验的一个很好的候选基因。

中科院动物检疫检疫所科学家应用AlphaLISA方法建立了高灵敏、免洗的针对ASFV p72检测方法。文献发表在Applied Microbiology and Biotechnology 。

那么，接下来小编将对本文章进行全面解析。拿出纸笔开始学起来。。。

一、制备ASFV p72单抗

单克隆抗体M-5和M-6是通过p72的原核表达制备免疫BALB/c小鼠。用BamHI和XhoI酶将p72基因插入pET30a质粒，在大肠杆菌菌株BL21/DE3中表达。使用Ni-NTA纯化得到重组p72，经SDS-PAGE和Western Blot分析两株单抗和p72结合的特异性。用Elisa检测M-5、M-6与p72配对情况，两株单抗靶向p72不同的抗原表位，M-5和M-6配对AI值高达96.7（接近100）。证实了这两种单抗可以一起作为特异性抗体在AlphaLISA中检测ASFV p72。

二、ASFV AlphaLISA检测方法的建立和优化

AlphaLISA检测p72技术原理示意如下。生物素化的抗p72单抗M-5与链霉亲和素包被的供体珠结合，单抗M-6与AlphaLISA受体珠结合。在p72存在的情况下，微珠相互接近。供体珠的激发使得单线态氧分子的释放，从而触发能量转移到受体珠的级联反应，在615nm处检测到信号。

AlphaLISA方法优化，分别对M-6偶联受体珠浓度(12.5、25、50和100μg/ml)、biotin-M-5浓度(0.75、1.5、1.5、3和6ng/ml)和两种供体珠浓度(20和10μg/ml)进行了测试。最终50μg/ml的受体珠、3ng/ml的biotin-5和20μg/ml的供体珠的组合产生最大信号比。可用于AlphaLISA标准曲线的建立和进一步的临床血清样本检测。

三、AlphaLISA标准定量曲线的建立

ASFV p72按100~1.5625ng/ml进行两倍连续稀释，得到检测p72的标准定量曲线。AlphaLISA信号随p72浓度增加而增强。线性回归方程为y=82.621x+225.83，其R2值为0.9999。ASFV阳性血清经两倍连续稀释（1：2~1：256），AlphaLISA信号与ASFV阳性血清稀释度之间也有良好的非线性回归（R2=0.9665)。 表明AlphaLISA信号与ASFV p72或ASFV阳性血清稀释度之间存在良好的线性或非线性关系。

四、ASFV AlphaLISA的Cut-off值、灵敏度和特异性

通过20份SPF猪血清确认ASFV AlphaLISA检测方法的cut-off值，读数为103至206，平均值为138.45，SD为26.87，因此平均值+3SD为264.05，当样品AlphaLISA值高于264.05判定为阳性，低于则是阴性。随后将p72倍比稀释不同浓度，测得检测下限（灵敏度）为0.78ng/ml。以CSFV、 PRV、PRRSV、PPV、PCV2和PEDV多种猪瘟病毒测试交叉反应，读数结果均低于cut-off值，证明ASFV AlphaLISA方法的特异性和准确性。

五、ASFV AlphaLISA方法评估

采集60份临床血清样本，同时采用ASFV AlphaLISA、Real PCR ASFV DNA检测和ASFV抗原检测试剂盒进行检测。样品60°C的水浴30min灭活。对采集的60份血清样本，Real PCR ASFV DNA检测结果显示，29份ASFV阳性，31份ASFV阴性。ASFV抗原检测试剂盒结果显示ASFV阳性24例，ASFV阴性36例，而ASFV AlphaLISA结果显示ASFV阳性27例，ASFV阴性33例。ASFV AlphaLISA未能检测到2份Real PCR ASFV DNA检测ASFV阳性，3份ASFV抗原检测阴性。

因此，与Real PCR ASFV DNA检测相比，AlphaLISA的敏感性为93.1%，特异性为100%，而与ASFV抗原检测试剂盒相比，ASFV AlphaLISA的敏感性和特异性分别为100%和91.7%。ASFV AlphaLISA与Real PCR ASFV DNA检测或ASFV抗原检测试剂盒的相应相关系数分别为0.967和0.95。

综上所述，优化并应用基于微珠的AlphaLISA检测猪血清中ASFV p72，具有高灵敏度、强特异性和强相关性，对快速准确检测ASFV具有良好的应用前景。

值得关注的是：

AlphaLSA是最可靠的技术之一，不需要洗板和包被，只需要5μl的样品来进行ASFV AlphaLISA。此外，这项技术可以用于测试384样品同时使用384孔板，所以应用这项技术将使测试大量的样品使用小样本体积在均相环境中，特异性强、相关性好，同时提供了相比ELISA方法更高的灵敏度和更宽的动态范围。

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AlphaLISA Beads
Name	Donor Beads	Acceptor Beads
Unconjugated	6762011	6772001
Streptavidin	6760002	AL125
Strep Tactin®	AS106	AL136
Anti-DIG	AS108	AL113
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Anti-DNP	AS111	AL173
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Nickel Chelate	AS101	AL108
Anti-6x His	AS116	AL178
Glutathione (GSH)	6765300/1/2/3	AL109
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Anti-c-myc	-	AL111
Anti-Protein C tag	-	AL172
Anti-FLAG®	AS103	AL112
Anti-GFP	AS112	AL133
Anti-HA	-	AL170
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Anti-Maltose-Binding Protein (MBP)	-	AL134
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Protein A	AS102	AL101
Protein G	-	AL102
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Anti-chicken IgY	-	AL131
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Anti-human IgE	-	AL176
Anti-human IgG (Fc-specific)	AS114	AL103

AlphaLISA Buffers
Name	10ml	100ml
PPI Buffer, 5X	AL015C	AL015F
Universal Assay Buffer, 5X	AL001C	AL001F
Immunoassay Buffer, 10X	AL000C	AL000F