肿瘤组织简介及样本的保存与制备

一、介绍
一般来说，肿瘤只是指组织的异常生长导致肿胀。这种生长可以是良性的，也可以发展为癌症，即恶性肿瘤或赘生物（neoplasm）。异常的组织生长是由组织内稳态被破坏引起的，即细胞分裂胜过细胞死亡。在恶性肿瘤中，潜在的机制是原癌基因和抑癌基因随着时间的推移而发生突变。负责肿瘤形成和进化的突变被称为驱动突变（driver mutations），通常伴有没有本质作用的背景突变（passenger mutations）。Hanahan和Weinberg在他们具有里程碑意义的综述升级版（Hallmarks of cancer: the next generation）中定义了癌症的十个特征：避免免疫摧毁(Avoiding Immune Destruction)、促进肿瘤的炎症（Tumor Promotion Inflammation）、细胞能量异常（Deregulating Cellular Energetics）、 基因组不稳定和突变（Genome Instability and Mutation）、自给自足的生长信号（Self-Sufficiency in Growth Signals）、抗生长信号的不敏感（Insensitivity to Antigrowth Signals）、抵抗细胞死亡(Resisting Cell Death)、潜力无限的复制能力(Limitless Replicative Potential)、持续的血管生成(Sustained Angiogenesis)和组织浸润和转移(Tissue Invasion and Metastasis)。这十个肿瘤细胞区别于正常细胞的特征是治疗肿瘤的靶点，是靶向治疗的基础阻止肿瘤生长和进展是治疗多种形式人类癌症的关键，目前正在开发针对每种特征的研究药物。
 

图1 癌症特征的靶向治疗（源自The next generation）

因为不同的组织来源，其命名又不同。癌，起源于上皮组织的肿瘤（如乳腺癌），是最常见的癌症类型。肉瘤起源于间充质组织，如骨骼肌或脂肪组织。神经外胚层组织可导致神经内分泌肿瘤，如小细胞肺癌，而淋巴瘤是淋巴系统肿瘤，最常见的是B细胞和T细胞淋巴瘤。相比之下，白血病是一种缺乏实体瘤的独特癌症类型。罕见的肿瘤类型，如畸胎瘤，来源于未分化的干细胞或生殖细胞，涉及多个生殖层。
1.1 肿瘤结构
几十年来，肿瘤被看作是一组可以通过分析这些细胞的内在特性来理解的同质癌细胞。今天，肿瘤被认为是与健康组织相似或更复杂的器官。只有通过研究肿瘤所包含的所有特殊细胞类型，以及肿瘤的局部微环境或基质，才能了解肿瘤的生物学特性。
 

图2 肿瘤微环境中的细胞（源自Miltenyi Biotec）

实体瘤由几种不同的细胞类型组成。总的来说，这些细胞类型使肿瘤生长和进展。肿瘤中的免疫炎症细胞发挥着尤为重要的作用，既能促进又能抑制肿瘤的生长。
肿瘤有三层异质性：肿瘤间异质性，类似于正常器官间的异质性；基于突变谱、微环境和其他因素差异的患者间异质性；肿瘤内异质性。
肿瘤内异质性是由肿瘤细胞不同亚克隆之间的内在差异，以及肿瘤及其微环境细胞组成引起的。并非所有患者的肿瘤细胞，实体瘤的所有肿瘤细胞都携带相同的突变。相反，肿瘤细胞根据自然选择有不同的遗传和表观遗传特征。这种克隆进化使实体癌的分子分析和治疗更加复杂。

新兴的肿瘤模型描述了这些基因和表观遗传学上不同的克隆以一种类似于正常组织的层次组织结构共存，在谱系组织的顶端有自我更新的干细胞。当注射到免疫受损的小鼠模型中时，只有少数肿瘤细胞能够再生并维持肿瘤生长。肿瘤层次结构中的第一个细胞被称为癌症干细胞（CSCs）。CSCs产生肿瘤谱系的所有子细胞，并可能导致治疗后的转移和复发。
实体瘤中的肿瘤细胞数量经常超过基质细胞，基质细胞通常包括免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞。
1.2 异种移植:一种人类肿瘤模型
在实验室动物（最常见的是小鼠）中模拟肿瘤的特征，以便更好地了解肿瘤生物学、治疗和在不太复杂的情况下的耐药性。
从已建立的细胞系中或直接从患者肿瘤获得的人类肿瘤细胞或组织可以移植到免疫缺陷小鼠体内。这些人类肿瘤异种移植是药物发现、癌症干细胞生物学和转移预测等领域研究方法的金标准。与体外细胞培养模型相比，人类肿瘤异种移植物在大多数检测中显示出更高的有效性。
异种移植模型的主要缺点是使用免疫缺陷小鼠作为宿主。这意味着基础肿瘤生物学的显著差异，并阻碍了免疫治疗研究的许多方面。为了克服这一限制，可以在具有人源化免疫系统的小鼠中生成人类肿瘤异种移植模型。人源化是通过移植PBMC或造血干细胞来实现的。然而，这些动物模型成本高昂，并且仍然受到不成熟免疫系统的阻碍。

二、组织保存
如果标本来自多个来源，在不同的时间点收集，或不能立即处理，肿瘤组织可能需要长时间的储存和运输。坏死、凋亡、干细胞功能丧失和免疫细胞活化可能在储存过程中发生，从而导致下游分析不准确。MACS组织保存液提供了新鲜肿瘤样本的最佳存储方式，没有背景效应，如细胞激活或凋亡诱导。它已经在多种人类和小鼠肿瘤组织上进行了测试和验证。
     

图3 使用MACS组织保存液或竞争对手产品存储组织的细胞量/细胞活性的比较

三、样本制备
有效地将肿瘤组织分离成活性高的单细胞悬液是许多下游分析的先决条件，如细胞培养或流式细胞术。无酶机械解离法可释放部分松散连接的浸润性免疫细胞。连接更紧密的细胞，如成纤维细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞、内皮细胞和树突状细胞，需要蛋白酶来有效地分解细胞外基质和细胞与细胞间连接。
由于在生产过程中被其他酶污染，粗消化酶具有非特异性的背景活性。因此，一些酶降解细胞表面表位。此外，批次间差异会导致下游实验如细胞分选、流式检测分析的结果不够准确。Miltenyi Biotec开发了一种简单的方法，结合机械解离和酶解，可获得肿瘤高数量的单细胞悬液。Tumor Dissociation Kit, human与gentleMACS Dissociator和gentleMACS C Tubes相结合，可快速制备人肿瘤和异种移植人肿瘤的单细胞悬液。酶的批次间一致性及自动化的机械解离可帮助得到可重复性结果。该方法也对表位的保存进行了检测，证明可以保存200多个抗原表位。

组织保存液

样本制备

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