HTRF®技术STING通路全面解决方案

STING信号通路不仅可以识别外源病原菌感染的DNA，而且可以识别自身细胞质中的DNA，诱发各种自身炎症性疾病。通路异常活化与Aicardi-Goutières综合征（AGS）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、婴儿期起病的干扰素基因刺激蛋白相关血管病变（STING-associated vasculopathy with onset in infancy，SAVI）等自身性免疫疾病的发生密切相关。
STING通路被激活后，由临近细胞产生更多的干扰素和相关细胞因子，产生放大信号的作用。随后，被招募的树突状细胞可以产生CD8+阳性的T细胞和其他炎性相关的细胞因子，促进淋巴结中针对肿瘤的特异性T细胞的交叉启动，产生免疫反应并杀死肿瘤细胞。STING可以作为肿瘤治疗中的药物靶点，被一系列的STING激动剂激活，包括：环状二核苷酸衍生物（CDNs），小分子药物，有机聚合物及金属离子。此外，STING激动剂在肿瘤的联合治疗中能够显著地增强抗肿瘤治疗的效果。
 

图1：STING通路解析

2022年4月11日，刘海鹏/陈昶/费义艳教授合作在EMBO Rports上发表题为CDK inhibitor Palbociclib targets STING to alleviate autoinflammation的研究成果。
 

图2：EMBO Rports文献

该研究通过高通量筛选，发现临床上使用的周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）4/6的抑制剂帕博西尼（Palbociclib）是STING的一种新型抑制剂，其可以直接靶向STING Y167，通过阻断STING二聚化这一独特机制抑制其活化过程。该研究发现了抗癌药物帕博西尼的全新靶点，并为帕博西尼及其类似物快速应用于STING驱动的自身免疫性疾病的临床治疗提供了新型候选药物，同时为基于帕博西尼进一步优化和开发新型STING抑制剂奠定了基础。
HTRF技术提供了基于生化水平初步筛选和细胞水平功能性验证的方法，深入研究STING通路。

生化水平筛选
基于HTRF技术的竞争模型检测原理，使用d2标记STING ligand，Tb标记6His STING WT的抗体，。加入的化合物与标记为d2的STING WT ligand 竞争，从而阻断FRET。特异性信号与化合物浓度成反比。
 

图3：STING binding Assay 原理

如下图所示，针对mouse STING的DMXAA化合物（紫色三角形），不与human STING ligand竞争结合。STING binding kit表现出高特异性，适合作为高通量筛选。
 

图4：STING binding Assay特异性结果

HTRF技术提供human和mouse STING相关的生化筛选试剂盒。

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细胞水平磷酸化蛋白和总蛋白检测
肿瘤来源的DNA激活环状cGAS（GMP-AMP）酶。cGAS催化ATP和GTP产生2‘3’cGAMP，一种环状二核苷酸(CDN)，2‘3’cGAMP作为第二信使与STING蛋白结合。磷酸化的STING招募TBK1后一同招募致IRF3使其磷酸化。进一步促使下游NF-kB的磷酸化。与此同时，触发STING蛋白自噬降解过程。
HTRF磷酸化和总蛋白检测均采用夹心法模型，一对特异性检测抗体分别标记有荧光能量供体和受体。这意味着FRET信号的强度与裂解液中PHOSPHO & TOTAL STING浓度成正比。
 

图5：PHOSPHO & TOTAL Protein 检测原理

STING激活是通过大量STING磷酸化水平提高和STING总蛋白自噬降解揭示的，与检测结果相一致，而Alpha-tubulin在相同条件下保持稳定。
 

图6：STING PHOSPHO & TOTAL Assay检测结果

下游通路中TBK1和IRF3磷酸化蛋白的检测，分别采取小鼠肝脏巨噬细胞ImKC细胞密度200000 cells/well，用2’3’cGAMP刺激1小时。人上皮细胞MCF7以125000 cells/well的密度，用2’3’cGAMP（75µM）刺激。结果所示，磷酸化的TBK1逐步上升且总蛋白基本保持一致。IRF3磷酸化蛋白呈现出上升趋势。
 

图7：TBK1和IRF3 PHOSPHO & TOTAL Assay检测结果

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下游通路IFNβ定量检测
磷酸化的IRF3导致IFNβ的分泌，磷酸化NF-kB导致其依赖的炎症因子的分泌，如TNFα, IL6, IL1β。最后，我们使用HTRF技术定量IFNβ的分泌，显示了cGAMP诱导的刺激活时的剂量依赖性的IFNβ分泌结果。
HTRF IFNβ检测依然采用夹心法模型，一对特异性检测抗体分别标记有荧光能量供体和受体。这意味着FRET信号的强度与分泌的IFNβ浓度成正比。
 

图8：IFNβ 检测原理

人PBMC 400000 cells/ well的速度接种，用2‘3’cGAMP刺激4h30min。在4h30min开始检测，可以检测到诱导的IFNβ分泌量。

图9：IFNβ 检测结果

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