翻译后修饰（PTM）检测技术介绍

蛋白质翻译后修饰(PTMs)，如磷酸化（phosphorylation）、乙酰化（acetylation）、sumo化、泛素化（ubiquitination）等，大大揭示了蛋白质组的复杂性。对于任何给定的蛋白质，各种PTMs通过改变蛋白质的结构和功能来促进细胞的快速变化。 PTMs在信号转导、蛋白稳定和转换、蛋白之间的识别和相互作用、及空间定位等方面发挥着重要作用。  
 
由于PTM在基础生物学和疾病发病机制中的重要性，识别每个目标蛋白(protein of interest，POI)的调节PTM机制具有重要意义。研究PTM修饰的POIs通常需要一个富集步骤，因为这些修饰蛋白的丰度相对较低。大多数PTM检测方法已经与富集策略相结合，为识别、验证和研究PTM对POI的调节功能提供了最佳机会[3,4]。然而，在有限数量的PTM修饰蛋白中，已经开发出了位点特异性PTM修饰抗体; 例如EGFR pY1045。在这些相对罕见的病例中，可能不需要富集步骤。 对于所有其他情况，请参阅下面有关常用的PTM检测方法的更多信息。  
 
选择合适的试验、方法和/或方案将取决于您试图回答的问题; 最后，建议结合使用这些方法对POI的PTM进行识别、验证和机理表征。 

基于免疫沉淀反应的技术

免疫沉淀(IP)是一种核心技术，用于几种不同的PTM检测方法。重要的是，IP允许研究人员在目标POI上富集特异性、低丰度的PTM修饰。富集是通过亲和纯化技术实现的。附着在固体支撑基质(如琼脂糖树脂)上的抗体(或特异性结合分子)与POI或PTM结合，而复合物裂解液中的非靶向蛋白不会被捕获并通过洗涤步骤去除。然后，用洗脱缓冲液将富集的蛋白质从支撑基质中除去，并在浓缩体积中分离。分离的群体通过下游方法进行分析，如western blot或质谱，以确定POI是否在翻译后修饰。
 

图1.免疫沉淀PTM修饰蛋白的一般工作流程。 利用优化的IP系统对检测目标POI的低丰度PTMs至关重要。

蛋白抗体特异性IP: Western Blot分析

蛋白质特异性IP利用针对POI的抗体来免疫沉淀该蛋白质的所有物种。然后通过SDS-PAGE分离富集的蛋白质，转移到PVDF膜上，并通过免疫印迹分析，方法是用靶PTM抗体探测。图2提供了利用POI抗体特异性IP的示例数据，其中使用SRF抗体检测磷酸丝氨酸抗体检测的IP的SRF-SRF检测。靶蛋白抗体IP传统上是用于确定POI是否被特定PTM修饰的第一种方法，这可能是由于研究人员在蛋白质印迹应用中的POI特异性抗体方面的专业知识。
 

图2.靶蛋白抗体特异性IP的例子。Hippocampal neurons from neonatal pups were grown for 3 d in the presence of either DMSO (vehicle) or 500 nM 6-BIO. Endogenous SRF was immunoprecipitated with anti-SRF antibody and immunoblotted with anti-phosphoserine antibody.

然而，如图1所示，在IP测定中使用抗体与在蛋白质印迹应用中的使用完全不同。通常，具有POI特异性抗体的IP失败，或者需要显着优化，因为它在IP与蛋白质印迹应用中执行不同的功能，这并不是超验的;因此，作为起点，确保POI特异性抗体已经过IP验证。对于初始发现实验，使用PTM特异性抗体进行IP可能是一种更简单的方法，其中IP是使用PTM特异性抗体进行的，POI特异性抗体用于蛋白质印迹分析。这种方法只需要优化IP步骤，而不必优化蛋白质特异性IP中可能需要的IP和蛋白质步骤。

另一个考虑因素是，先前的研究表明PTM修饰可能会阻断POI上的抗体结合位点;因此，假阴性是可能的。PTM 特异性 IP 或卵峰 IP 均可避免此问题，如果靶抗体 IP 失败，应考虑使用。

PTM 抗体特异性 IP：Western Blot分析
PTM特异性IP利用针对靶标PTM的抗体来免疫沉淀所有已被该PTM修饰的蛋白质（取决于PTM亲和试剂的质量）。然后通过SDS-PAGE分析分离富集的翻译后修饰群体，将其转移到PVDF膜上，并通过蛋白质印迹分析，方法是用靶向特定POI的抗体进行探测。
 

图3.PTM特异性IP

图3显示了使用酪氨酸磷酸化，泛素化，乙酰化和SUMOylation2/3 PTM亲和珠的PTM特异性IP的示例。通过用EGFR抗体探测来分析这四种修饰的EGFR PTM谱。这种方法非常适合于任何POI的新型PTM的初始发现。PTM特异性IP富集也常用于自下而上的蛋白质组学（有关详细信息，见下文），并且在研究全局PTM变化时可能是有益的。

PTM特异性IP方法尤其合理，因为试剂盒以这种格式提供，这使得研究者能够绕过蛋白质特异性IP出现的问题。例如，在试剂盒形式中，抗体通常与磁珠偶联，以尽量减少重链和轻链浸出。信号导引器PTM检测试剂盒特别为研究人员提供了关键抑制剂，优化的缓冲液系统和过滤器，以增强修饰蛋白质的分离，并缩短优化时间。信号导引头试剂盒的一个显著优点是它能够捕获低丰度、内源性PTM。

过表达IP：Western Blot分析

过表达IP是一个完善的系统，其中POI标记版本的质粒被转染到细胞中。这通常会导致标记的POI的高表达水平，其可以用针对标记的表征良好的抗体（例如标志）进行免疫沉淀。增加的表达和优化的抗体提高了鉴定PTM修饰POI的机会。过表达IP测定通常通过蛋白质印迹进行分析。图4概述了实验过程，但仅总结了转染步骤，因为它可能因方法和细胞类型而有很大差异。

当POI的PTM难以进行内源性研究时，过表达系统尤其重要;然而，任何关键发现均应使用内源性蛋白验证其真实性[10]。尽管如此，过表达方法的一个显着好处包括能够创建靶蛋白的突变形式，以确定哪些特定氨基酸被特定的PTM修饰。

重要的是要注意，过表达IP测定对于分析靶蛋白生理PTM状态的变化无效，因为过表达可能会掩盖结果。表达不仅是人为的，而且标签也可能干扰PTM调节和蛋白质相互作用。在研究靶 POI 的生理 PTM 变化时，建议使用免疫沉淀内源性蛋白，这可以使用标准蛋白或 PTM 特异性 IP 来实现。

如果过表达没有标记的蛋白质，则应使用蛋白质或PTM抗体IP进行IP。在许多情况下，进行过表达是因为POI特异性抗体不起作用。在这些情况下，利用像信号导引头套件这样的综合IP检测系统可以提供最佳的扩充策略。
 

图 4.过表达IP测定中检测PTM修饰靶蛋白的一般步骤。Transfection protocols and efficiencies varies significantly by methodology and an appropriate transfection method should be identified prior to PTM investigation.

IP富集后的质谱
 

图5. 一个泛素化蛋白的质谱数据鉴定的例子。biquitinated proteins were enriched using the Signal-seeker ubiquitnation detection kit.  Samples were run on SDS-PAGE.  In-gel digest was performed, and samples were run on a Q Exactive HF nanoLC-MS.

几乎所有PTM的质谱分析在与上面讨论的IP策略相结合以富集感兴趣的蛋白质或PTM时都更有效。而不是进行蛋白质印迹以确定特定蛋白质是否被修饰，而是使用质谱仪分析样品。

质谱法的其他好处是其潜在的无偏倚方法，以及独立于抗体检测PTM修饰蛋白。虽然质谱理论上提供了PTM修饰蛋白质的无偏倚快照，但它有几个限制，这些限制偏向于某些类型的蛋白质。一些技术挑战包括蛋白质丰度偏倚和方法灵敏度。

体外： 生化检测
生化测定利用靶蛋白的纯化或体外翻译版本来确定其是否可以由特定的PTM修饰。将纯化的蛋白质加入具有特定酶（例如E1，E2，E3泛素连接酶）和适当底物（例如泛素），辅助因子和能量来源的试管中。孵育后，通过蛋白质印迹分析分析样品。图6提供了细胞凋亡蛋白BimEL的体外泛素化的示例。
 

图6 细胞凋亡蛋白BimEL的体外泛素化的示例

体外生化分析并非适用于所有类型的PTM;然而，常规进行体外PTM分析以验证磷酸化，泛素化，SUMOylation和其他PTM修饰。进行体外生化测定的一个限制步骤是获得POI的纯化版本。

免疫荧光对全局PTM的研究

免疫荧光技术可能是研究组织或细胞中PTM谱全局变化的一种富有成效的方法。特别是，使用这种方法可以识别对药物治疗（例如HDAC抑制剂）或遗传敲除的全局和空间变化。图7显示了利用信号导引头乙酰赖氨酸抗体探测总乙酰赖氨酸变化的示例数据。几种信号导引头PTM抗体已经过IF应用验证。
 

图7.使用泛乙酰化抗体获得的免疫荧光数据的例子。3T3 cells were either untreated or treated with TSA for 6 hours. Cells were fixed and stained with pan-acetyl lysine antibody.

不过，通过这种方法无法识别目标特异性PTM修饰。

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