玩转KRAS

RAS基因是逆转录病毒相关的DNA序列，存在于所有哺乳动物细胞中，它们表达RAS蛋白。这些蛋白是重要的胞质信号转导器，可调节许多细胞内功能，包括细胞的生长、增殖、分化和存活。

RAS蛋白突变已被发现导致超过30%的人类癌症。KRAS亚型占所有RAS突变的85%。其突变会涉及胰腺癌、结肠癌和肺癌等。因此，全球正在开展密集的研究计划，以开发针对KRAS驱动的癌症的有效治疗方法。

KRAS可以被细胞外信号以及来自细胞器等亚细胞结构的信号所激活。在正常的生理环境下，野生型KRAS主要处于不活跃的GDP结合状态。信号促使KRAS脱离GDP，并与GTP结合，将KRAS转化为激活状态。KRAS从其非活性形式向活性形式的转化是由GEFs介导的，而重新向非活性形式的转化是由GAPs介导的。

激活的KRAS能够结合并激活效应蛋白，如RAF激酶、PI3K和RalGDS，促进下游级联的信号通路，如MAPK、PI3K和Ral-GEFs通路。这些信号通路通过细胞复制、生长、分化和促进细胞周期进程。
 
一个激活的致癌KRAS基因导致一个突变的KRAS蛋白，由于GTP水解率大大降低，异常长时间保持其活性GTP结合状态。当KRAS蛋白被困在“ON”位置时，下游效应通路也保持活跃，细胞增殖率保持很高。其他仍然活跃的效应通路包括那些促进肿瘤发展过程的通路，如有丝分裂、细胞迁移、肿瘤侵袭和血管生成。
 
2022年6月2日，美国波特兰普罗维登斯癌症中心Earle A. Chiles研究所的Rom Leidner，Eric Tran等人于《新英格兰医学杂志》(The New England Journal of Medicine)发表了题为“Neoantigen T-Cell Receptor Gene Therapy in Pancreatic Cancer”的文章，报道了T细胞免疫疗法治疗KRAS G12D突变胰腺癌的突破性疗法。
 
6月2 日，又一个国产KRAS G12C抑制剂拟纳入突破性疗法。D-1553是益方生物自主研发的 KRAS G12C 突变的口服抑制剂，在临床前研究中显示出优异的选择性及肿瘤抑制效果。益方生物首次公布了D-1553在癌症患者中的临床数据。在一项针对携带 KRAS G12C突变的晚期或转移性实体瘤患者的国际多中心 I期研究中 ，D-1553在22例患者中耐受性良好，没有观察到任何剂量限制性毒性。在21例可评估的患者中，观察到19.0%确认的客观缓解率 ，疾病控制率为85.7%。

大多数KRAS突变检测方法采用PCR扩增和检测方法相结合的方法来识别野生型和突变型序列。扩增方法可以包括分子或等位基因特异性PCR。

今天小编为大家提供一个免洗，快捷，灵敏度高的高通量检测方法...敲黑板，记笔记啦！

抑制剂筛选
HTRF^®技术提供均相，免洗KRAS结合检测试剂盒，通过这些已验证的试剂盒，可直接用于抑制剂筛选，无需优化，每个试剂盒都有重组蛋白、检测试剂和分析缓冲液。

如下图所示，使用抗Tag1-SOS1（供体）和抗Tag2-XL665（受体）检测Tag1-SOS1与Tag2-KRAS-G12C之间的相互作用。当供体和受体抗体由于SOS1和KRAS-G12C结合而接近时，供体抗体的激发触发向受体抗体的荧光共振能量转移(FRET)，受体抗体在665nm处特异性发射。这种特异性信号与KRAS-G12C/SOS1相互作用的程度成正比。因此，化合物或抗体阻断KRAS-G12C/SOS1的相互作用会导致HTRF^®信号的减少。
 

使用已知抑制剂对试剂盒进行验证，均获得相应较好的IC50并且与已报道文献结果相一致。
 
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下游磷酸化蛋白检测
一个全面的基于细胞的分析组合(AlphaUltra^®和HTRF^®)，进行下游KRAS信号通路的研究，包括MAPK、PI3K和Ral-GEFs通路。这些细胞信号分析能够区分化合物调节下游KRAS通路的功效。

HTRF^®仍然利用夹心法原理，标记的特异性抗体识别磷酸化蛋白和总蛋白从而进行定量检测。全过程无需洗涤，特异性好，灵敏度高，
 
下图为p-ERK和p-NFkB磷酸化试剂盒灵敏度与WB对比，灵敏度高出30倍不等。
 

与HTRF^®技术不同，Alpha^®虽然也是均相检测检测技术，但其基于化学发光原理，利用两个微珠进行检测来实现更低的实验背景和超高灵敏度。一个抗体被生物素化并与链霉亲和素包被的供体微珠结合，受体微珠则直接与另一个抗体结合。抗体与磷酸化蛋白（总蛋白）结合使供体和受体微珠靠近。供体微珠的激发使得单线态氧扩散至受体微珠，从而发射615nm波长的光信号。Alpha^®的检测信号与样本中存在的磷酸化蛋白（总蛋白）的数量成正比。HTRF^®检测原理下图（左），Alpha^®原理下图（右）。
 
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