检测细胞增殖/毒性，一步法轻松搞定 --ATPlite 1 step assay

ATP检测发光法是比色法、荧光法和放射性同位素法的一种替代方法，可用于定量评价培养的哺乳动物细胞的增殖和细胞毒性。这里测试的所有三种ATP检测发光分析都是均相的、免洗，适合96孔和384孔，使它们成为细胞增殖和细胞毒性高通量筛选的理想方法。

在这些检测中，培养中活细胞的数量是通过定量ATP来确定的。ATP是细胞活力的标志，因为它存在于所有代谢活性的细胞中，因此，ATP的数量与培养中活细胞的数量成正比。如果细胞数量因增殖而增加，那么ATP的数量就会增加；如果细胞数量因细胞死亡而减少，则ATP的数量就会减少。

从裂解细胞中释放的ATP在氧气的存在下与荧光素底物、荧光素酶和镁反应产生光，反应原理如下所示。然后使用酶标仪luminescence模块对发射的光进行量化，由此测量的发光信号与样品中ATP的数量成正比。
 
材料和方法
细胞培养和处理
采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMCs)，取自两个献血的健康个体。细胞被置于白色96孔TC处理的96孔培养板，在RPMI-1650培养基中，添加10%胎牛血清和2mml-谷氨酰胺。

标准品制备，建立光强度与ATP浓度关系，冻干ATP标准品用水溶解为浓度10nM，使用培养基3倍6个梯度连续稀释最大浓度为1.25µM。为了建立处理细胞时的线性范围，对PBMCs进行2倍8个梯度连续稀释，每孔最大密度为2.5x105PBMCs。实验开始前，细胞在37 °C, with 5% CO2中孵育1小时。

观察细胞毒性，PBMC细胞以每孔1x105个细胞的密度布孔。在1µg/ml抗CD3和1µg/ml抗CD28的存在下，对DMSO进行2倍、7点连续稀释至最大浓度为10%。处理后的细胞在37°C，5%CO2培养96小时。

观察细胞增殖，PBMC细胞以每孔1x105个细胞的密度布孔。将抗CD3和抗CD28进行2倍、9点的连续稀释至最大浓度为4µg/ml（每个抗体）。处理后的细胞在37°C，5%CO2培养96小时。

ATP检测细胞分析
我们评估了三种ATP检测方法：ATPlite 1 Step，ATPlite以及同类型商品三种检测方法。所有试剂均按照制造商的说明书制备。

 
结果与讨论
ATP标准曲线
测定对ATP的敏感性是通过检测ATP的连续稀释度(3倍，最大1.25µM)来确定的。对于三种试剂盒，ATP检测在从~1nM到1µM的三个量级上都是线性的。在这个动态范围内，试剂盒之间的检测比保持不变。ATPlite1step试剂盒显示了最大的信噪比(S/B)。这种优越的检测窗口表明了对ATP的高灵敏度，允许可靠地检测ATP浓度的微小变化。ATPlite检测获得的较低信号强度，相应稳定较好，长达5小时的半衰期，而其他检测试剂盒应在添加试剂后30分钟内读取。
 
对人PBMCs产生的内源性ATP的敏感性
通过检测PBMC悬浮液的连续稀释度(2倍，2.5x105PBMCs max)，来测定其对人PBMCs产生的ATP的敏感性。 ATP检测在两个数量级上呈线性变化，从1.9x103到2.5x105 PBMCs。ATPlite 1 step试剂盒检测的ATP的灵敏度最高。根据标准曲线，发光可以转化为ATP浓度，2.5x105 PBMCs对应2.5x10-7M ATP(donor A)和4x10-7M ATP(donor B)。与donor B相比，donor A的回归斜率较小，这表明了供体特异性的差异，即donor B的PBMCs在代谢上比donor A的PBMCs更活跃。这些结果表明，PBMC的数量反映在三种ATP检测发光法检测到的ATP的数量上。
 
PBMC细胞毒性检测
DMSO被用作诱导人骨髓瘤细胞毒性的化合物，增加DMSO浓度，与PBMCs孵育96小时，导致发光信号下降，反映出DMSO存在时细胞活力受损。通过ATPlite 1 step获得了最大的检测窗口。这从donor A的曲线斜率可以看出，donor A的PBMCs对DMSO的反应比donor B的PBMCs更敏感。这些结果表明，诱导的PBMC细胞死亡导致ATP的减少，三种ATP检测试剂盒都可以检测到，能够检测到相似的供体特异性差异。
 
PBMC增殖检测
以抗CD3/抗CD28抗体组合作为诱导PBMCs细胞增殖的试剂。随着抗CD3/抗CD28浓度的增加，发光信号增加，反映了诱导的细胞增殖。与预期的一样，来自donor A的EC50值较高。当donor A的PBMCs在0.625µg/ml抗CD3/抗CD28时达到最大增殖能力时，当donor B PBMCs对4µg/ml抗CD3/抗CD28的增殖反应增加，但没有达到平台期。这些结果表明，诱导的PBMC增殖导致ATP的增加，ATP检测试剂盒具有较高的灵敏度。
 
结论
结果表明，ATPlite 1 step在S/B比表现良好。ATPlite可能用于检测同质细胞群较高ATP浓度下的ATP变化；虽然它产生的光强度较低，但它的优点是提供一个随时间更稳定的信号（半衰期>4小时），这在工作流程中提供了更多的灵活性。ATPlite 1 step的高S/B比和一步法简单的操作流程，成为检测原代人PBMCs细胞增殖和细胞死亡的优秀检测技术。

ATPlite™1step特点与优势
①高灵敏度、宽动态范围：每孔可检测数个至数万个细胞。 
②无需洗涤：Mix & Measure 匀相检测技术使检测步骤更少。 
③长时间发光：发光信号持续时间长，可进行连续处理或批处理。

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