【神经研究】——高分文献及多维度研究思路分享

今天小优为大家带来神经领域研究中单细胞多组学技术的应用案例，同时为大家提供了从基因、蛋白、组织到细胞的多维度实验思路。

基因分析
一、Nature Communications:发现阿尔茨海默病潜在治疗靶点
 
阿尔茨海默病(AD)的脂质异常是人们了解最少的。本文研究了脂肪酸去饱和的关键调节因子硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)在AD发病机制中的作用。发现在AD的3xTg小鼠模型中，抑制大脑SCD活性1个月改变了海马中与AD相关的核心转录组通路，并同时恢复了海马功能的重要组成部分，包括树突刺和结构、即时早期基因表达以及学习和记忆本身。此外，SCD抑制小胶质细胞的激活。这些数据表明，脑脂肪酸代谢将AD基因与下游的免疫、突触和功能损伤联系起来，表明SCD是AD治疗的潜在靶点。
为了更好地了解早期有症状的3xTg海马体的遗传状态，研究者对8个月大的雌性野生小鼠和3xTg小鼠进行了全海马bulk RNA测序及单细胞RNA测序。
 
小胶质细胞仅占海马细胞的5-10%，存在于多种细胞状态，对组织加工应激高度敏感，因此在其原生环境下研究具有挑战性。研究者使用温和的、基于微孔的BD Rhapsody单细胞系统，以最大限度地提高细胞活力和产量。

二、在Aβ淀粉样变小鼠模型中，Abi3基因位点缺失加重阿尔茨海默病的神经病理特征
 
最近，在大规模的人类遗传学研究中，发现了与阿尔茨海默病(AD)风险增加有关的ABI3基因的罕见编码变异。然而，ABI3参与AD发病机制的途径尚不清楚。为了解决这个问题，我们确定了ABI3功能的丧失是否会影响5XFAD小鼠模型中AD的病理特征。我们证明，Abi3位点的缺失显著增加了淀粉样蛋白(Aβ)的积累，并减少了斑块周围小胶质细胞的聚集。此外，在5XFAD的Abi3敲除(Abi3- /-)小鼠中，长期增强作用受损。此外，我们使用单细胞RNA测序方法发现Abi3- /-小鼠中小胶质细胞亚群的比例发生了显著变化。机制研究表明，Abi3基因在小胶质细胞中被敲除会损害细胞的迁移和吞噬功能。总之，我们的研究首次提供了体内功能证据，证明ABI3功能丧失可能通过影响Aβ积累和神经炎症增加AD发展的风险。

三、神经元研究: FGF21激素在大脑中起到抑制糖分摄入和调控甜味偏好的重要作用

 成纤维细胞生长因子21（Fibroblast growth factor 21，FGF21）是一种肝脏源激素，可向下丘脑腹内侧（ventromedial hypothalamus，VMH）的谷氨酸能神经元发出信号，以抑制碳水化合物的摄入。在此项试验中，来自爱荷华大学医学院和丹麦哥本哈根大学的研究团队充分利用了BD Rhapsody单细胞测序平台，以合理评估哪些细胞能够在下丘脑中表达FGF21的辅助受体KIb（β-klotho）：首先通过BD FACS AriaII对小鼠下丘脑中的目标单细胞进行筛选，然后将筛选出的细胞加载到BD Rhapsody上捕获单个细胞，并进行cDNA的合成。后续，使用两个定制引物panel生成cDNA文库，该panel由BD设计，分别包含低丰度表达基因和高丰度表达基因。通过该方法以及BD Resolve analysis pipeline，研究人员对活细胞进行了有效的细胞排序、质量过滤和测序数据注释，最终获得了1,904个分类后推定的Klb细胞。随后，运用tSNE分析和无监督聚类，确定了12个神经元和非神经元细胞类型的聚类。通过这一途径，研究人员得以精确识别下丘脑中的FGF21靶细胞，并揭示了激活谷氨酸能神经元的FGF21信号是介导FGF21诱导的糖抑制和甜味偏好的必要和充分条件。

文章同款技术:BD Rhapsody单细胞平台
BD Rhapsody平台对于单细胞的捕获是基于自然沉降原理，不会对神经研究中的脆弱细胞造成额外损伤，无外界压力刺激，同时平台可以捕获异型细胞，直径<50um，对于细胞活性要求>50%

蛋白分析
一、《Nature》星形细胞白细胞介素-3编程小胶质细胞并限制阿尔茨海默病
哈佛医学院研究团队在人类和小鼠中发现，星形胶质细胞来源的白细胞介素-3（IL-3）对小胶质细胞进行编程以改善AD的病理学。在识别出Aβ沉积后，小胶质细胞增加其IL-3Rα的表达——IL-3的特异性受体（也称为CD123）——使其对IL-3产生反应。星形胶质细胞组成性地产生IL-3，其诱导小胶质细胞的转录、形态和功能编程，从而赋予它们急性免疫反应程序、增强的运动性以及聚集和清除Aβ和tau聚集体的能力。这些变化限制了AD的病理学和认知能力的下降。
 
通过MSD多阵列电化学发光分析试剂盒同时测量培养基中Aβ38、Aβ40和Aβ42的水平，并检测10种人趋化因子的相对表达，研究发现IL-3是星形胶质细胞-小胶质细胞相互作用的关键介质，也是AD治疗干预的一个节点。

二、神经重磅标志物：GFAP
GFAP是胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）的英文简称，是星形胶质细胞活化的标志物。胶质纤维酸性蛋白。神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在。星形胶质细胞增生往往伴随胶质纤维酸性蛋白GFAP的表达增加。因此，GFAP可作为中枢神经系统损伤时星形胶质细胞增生的生物标志物。最近，对血液中GFAP浓度的分析已经证明，血浆GFAP可区分阿尔兹海默症不同阶段。

文章同款技术:
MSD是第三代免疫分析技术，基于电化学发光的原理，只需要25uL样本即可一次性检测10个指标，具有fg/mL的检测灵敏度，比pg/mL灵敏度提高1000倍，4-5log检测范围，在神经疾病研究中，尤其对于脑脊液等珍贵样本，可以实现25uL样本同时检测Aβ38、Aβ40和Aβ42。
人pTau181检测，检测范围可达77 - 990,000 fg/mL
人Tau (total)检测灵敏度可达12 - 90,000 fg/mL
人GFAP检测范围可达330 - 2,300,000 fg/mL

组织分析
一、对于小胶质细胞激活检测
暴露于神经毒性药物会导致炎症反应，如激活的小胶质细胞。检测活化的小胶质细胞对于了解化合物的毒性是至关重要的。HALO Microglial Activation可检测小胶质细胞、细胞体及其过程，并最终报告激活的小胶质细胞数量、失活的小胶质细胞的数量以及检测到的阴性（非小胶质）细胞的数量。
 

HALO 定量分析小胶质细胞的激活状态。（左：小胶质细胞-棕色；右：激活小胶质细胞的细胞体-红色，未激活或休眠的小胶质细胞-绿色）

文章同款技术:
HALO是专业的病理图像处理及分析软件，具有简单易用的操作界面，快速的分析速度及高通量的工作流程，为数字病理的全组织切片分析提供逐个细胞/对象的精准数据结果。针对H&E、免疫组织化学、免疫荧光、原位杂交、荧光原位杂交、TMA 组织芯片以及特殊染色等数字病理切片，HALO数字病理图像分析平台提供组织分型、区域面积定量、细胞（胞核/膜/浆免疫标记物标记）定量、细胞及组织特征的空间分布分析。

细胞层面
Lonza核转染技术
 
电转通常需要细胞处于悬浮状态进行转染。Lonza 4D NucleofectorTM Y 模块为客户提供了更多的选择，直接在细胞贴壁状态下进行电转。尤其适用于原代培养神经元，可以用Y模块转染而不影响其功能，效率高达70%