WB/ELISA/IHC/FC实验指南：如何选择合适的对照剂和封闭剂？

你是否遇到过以下几种难题，IHC实验结果不准确，背景高；多标记免疫组化实验中一抗种属来源相同时，不知该如何进行实验；IP/Co-IP后的WB实验出现非特异性条带；流式实验中没有合适的直标一抗......你是否知道通过选择正确的对照剂和封闭剂，可以帮助你解决这些实验中遇到的难题，且更容易获得准确的实验结果。本文将给大家带来流式细胞实验、WB、ELISA、IHC几大实验中常见的问题，及解决办法。

流式细胞实验（Flow Cytometry）

可能遇到的问题	解决办法	适用试剂
因抗体与样本中的Fc受体相结合而产生不需要的背景	对Fc受体进行封闭	标准封闭血清（血清应与标记的抗体种属来源一致）
	使用F（ab'）2形式的二抗来防止二抗与Fc受体的结合	F（ab'）2形式的二抗
如何确认一抗与抗原是特异性结合	使用同型对照抗体*作为阴性对照，用于显示一抗有进行特异性结合 *同型对照抗体指的是一种和一抗来源相同的没有特异性的IgG蛋白	ChromPure™ 纯化蛋白
如何确认二抗产生的是目的信号	使用同型对照抗体*作为阴性对照，用于显示二抗有进行特异性结合 *同型对照抗体指的是一种和一抗来源相同的没有特异性的IgG蛋白	ChromPure™ 纯化蛋白
在没有直标一抗的条件下想要加快实验进度	在孵育样本之前使用Fab片段抗体先与一抗孵育	FabuLight™ Fab片段抗体

Western Blotting实验

可能遇到的问题	解决办法	适用试剂
出现非特异性条带	在用一抗孵育前，使用适当的阻断试剂阻断膜	标准血清（5%v/v）（血清应与标记的抗体种属来源一致），或BSA（5%w/v）（不含IgG蛋白和蛋白酶）
	如果使用来自山羊、马或绵羊的一级抗体，则避免使用牛奶或牛血清白蛋白。牛的IgG可能与抗体相互作用，这是由于近缘种的同源表位。	标准血清（5%v/v）（血清应与标记的抗体种属来源一致）
IP后WB实验时，目标蛋白分子量位于25kDa或25kDa附近时，想要消除来自IP实验的抗体干扰	为了避免检测到50 kDa的抗体重链，使用抗轻链特异性的二抗。	抗轻链特异性的二抗
	为了避免检测到25 kDa的抗体轻链，使用单价Fab片段进行阻断后，使用抗IgG且抗Fc端特异性的二抗。	抗Fc端特异性的二抗+Fab片段二抗（FabuLight™）

ELISA实验

可能遇到的问题	解决办法	适用试剂
高背景	在与一抗孵育之前，使用适量封闭试剂进行完全封闭	标准血清（5%v/v）（血清应与标记的抗体种属来源一致），或BSA（5%w/v）（不含IgG蛋白和蛋白酶）
无信号	使用阳性对照证明带标记二抗的活性，并在孵育了一抗同型对照后直接用二抗来检测	ChromPure™纯化蛋白

关于使用牛血清白蛋白(BSA)和牛奶作为封闭剂的Tips：
BSA和dry milk有时含有牛的IgG。除了Jackson提供的牛来源抗山羊IgG的二抗外，许多其他的如抗牛、抗山羊和抗绵羊的二抗都会与牛的IgG发生反应。因此，使用BSA或dry milk进行阻断或稀释会显著增加背景并降低抗体效价。使用与二抗种属来源一致的标准血清(5% v/v)来进行阻断是更好的选择。

免疫组化实验

可能遇到的问题	解决办法	适用试剂
如何确认一抗与抗原是特异性结合	使用同型阴性对照(与一抗物种相同的非特异性IgG)来证明一抗与抗原的特异性结合	ChromPure™纯化蛋白
高背景（General）	将可能会与其他试剂结合的内源性结合位点都封闭起来	标准血清（血清应与标记的抗体种属来源一致）
	在没有载体蛋白的缓冲液中稀释抗体，并将该混合液离心以剥离沉淀物	如PBS/Tween 20等缓冲液
因识别同源性免疫球蛋白而产生高背景	使用经过预吸附处理的二抗来减少细胞或组织样本中相关物种之间的交叉反应	经过预吸附，最大程度消除物种间交叉反应的二抗
	封闭内源性免疫球蛋白	Fab片段二抗
多标免疫组化实验时一抗种属来源相同	根据protocol使用Fab片段二抗来完成多标实验	Fab片段二抗
	在孵育前先对一抗进行免疫标记	FabuLight™
内源性酶	使用过氧化物封闭内源性过氧化酶	过氧化物
	使用levamisole封闭内源性磷酸酶	levamisole
内源性生物素	封闭内源性生物素	使用streptavidin（链霉亲和素）孵育，以消除内源性生物素
离子作用或疏水作用	在缓冲液中加入合适的试剂，优化盐浓度和pH值	Tween 20 或/和Triton X-100

免疫试剂
上文中提到的能够帮助解决实验里出现的问题的免疫试剂介绍如下：

·  标准血清（Normal Serums）
标准血清来自未产生免疫反应的动物，因此不会检测到任何特异性抗原。在PBS(或类似的缓冲液)中稀释到5% (v/v)的标准血清被强烈推荐作为阻断剂，以减少非特异性、保守序列和/或fc受体结合的背景。最好的结果是使用稀释的来自同一宿主的正常血清作为标记抗体，在加入一抗之前作为单独的孵育步骤。

相关产品推荐：

产品	货号	规格
胎牛血清(标准级)	abs974	25ml/125ml/500ml
马血清（标准级）	abs990	125ml/500ml
驴血清	abs935	50ml

·  从标准血清中提取的ChromPure™纯化蛋白（ChromPure™ Purified Proteins from Normal Serums）
ChromPure™蛋白主要用作一抗或二抗的实验对照。它们也可用作Western blotting, IHC和IF的阻断试剂。ChromPure™蛋白来源于未免疫动物的血清，不识别任何已知的抗原。它们是使用各种色谱技术制备的，以产生无污染分子观察到的浓度高达20 mg/ml的材料，使它们成为最敏感的测定的实验对照的理想选择。ChromPure™蛋白可用于许多物种的各种格式，包括全免疫球蛋白，F(ab’)2和Fab片段。

人IgM、血清IgA和其他蛋白质也可用。Jackson为该产品线提供了广泛的偶联物，包括一系列荧光染料和示踪酶，允许从非特异性相互作用中分辨出信号。

相关产品推荐：

产品	货号	规格
ChromPure Mouse IgG, whole molecule	015-000-003	5mg
ChromPure Bovine IgG, whole molecule	001-000-003	10mg
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule	011-000-003	10mg

·  单价Fab片段亲和纯化抗体
亲和纯化抗体fab片段可用于阻断内源性免疫球蛋白以减少背景染色和双标记来自同一宿主物种的主抗体。下面的例子展示了在小鼠组织上使用小鼠一抗时，如何使用Fab片段阻断内源性免疫球蛋白。

相关产品推荐：

货号	产品名	规格
115-007-003	AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	1mg
315-007-003	AffiniPure Fab Fragment Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)	1mg

·  牛血清蛋白（无IgG，无蛋白酶）
牛血清白蛋白(BSA)被广泛用作稀释抗体的载体蛋白，并在免疫测定和免疫检测方案中作为一种常用的蛋白质阻断剂。如果牛血清蛋白是您的试验所需的稀释剂或阻断剂，那么使用适合此目的的牛血清蛋白是很重要的。

牛IgG与山羊、绵羊和马的IgG有许多共同的表位，可以成为针对这些物种的二抗的靶点(牛抗山羊IgG除外)。这也可能发生在与牛IgG有交叉反应的其他抗体上。这些相互作用可能导致抗体活性的损失和/或背景增加。这些背景的产生可能来自于粘稠可溶性免疫复合物，或来自于因牛IgG蛋白的污染而产生的非特异性交叉反应。

关于JacksonImmunoresearch
Jackson ImmunoResearch Inc.是美国著名的二抗生产商。30年的专注，30年的发展，JIR公司除了提供各种酶标（如鼠兔酶标二抗）及荧光二抗（Alexa Fluor系列，Cy3/Cy5,PE等荧光标记），种类丰富，涉及物种齐全，标记多样，应用（WB/IF/IHC/FC）广泛，性价比高。  

上海优宁维生物科技股份有限公司作为二抗金标准Jackson的全国代理商，携手Jackson为广大科研及工业客户带来品质优良价格实惠的各类二抗产品。