活体转染应用第六弹~

哈喽，艾瑞巴蒂！今天碎碎带来了活体转染第六弹，给大家浅谈一下活体转染试剂在癌症启动子特异性选择中的应用。

本次选取的这篇文章发表在Cancers，题为-Conversion of a Non-Cancer-Selective Promoter into a Cancer-Selective Promoter。 

此项研究发现一种特异性调节癌细胞中转基因表达的遗传工具，可以通过在大鼠pGADD(GADD34最小启动子)中引入特定的点突变将这种非癌症特异性启动子转化为癌症选择性启动子, 并且添加GATA2和现有的AP1和PEA3转录因子将进一步增强了GAPE-Prom的癌症选择性活性。GAPE-Prom提供了一种特异性调节癌细胞中转基因表达的遗传工具。

背景:
PEG3是一种广谱的肿瘤特异性基因,在人癌细胞系中明显高表达,而在正常组织细胞中极少表达，它的启动子表现出癌症选择性表达，允许转基因的癌症定向调节，病毒复制和动物肿瘤和转移的体内成像。而GADD34的过表达抑制生长并诱导细胞凋亡，它的启动子缺少癌症特异性。但是PEG-3和GADD34的最小启动子具有强烈的序列同源性，除了两个单点突变。本文探索了改变这两种核苷酸在决定癌症选择性基因表达中的相关性。

接着我们具体看看文章中活体转染的应用思路吧

首先为了确定为什么pPEG（PEG34最小启动子）与pGADD的功能差异，比较了二者序列，发现两个不同的碱基对，后对pGADD进行定点突变，转化为pPEG，称pGAPE。后将启动子克隆到载体上后转化进人的癌细胞，原代细胞，以及正常的永生细胞中，进行荧光素酶检测。
结果表明pGAPE与pPEG在癌细胞中表现出类似的高表达。而在上的所有细胞系中， pGADD活性没有显著变化(Fig 1)。

Fig.1 在癌细胞中pGAPE展现出与pPEG类似的高表达

接着，作者验证了肿瘤动物体内pPEG和pGAPE启动子的癌症特异性。使用in vivo jetPEI 进进行不同启动子的传递和成像。在这里，作者选取雄性无胸腺裸鼠，进行全身给药。40 μg DNA 和 4.8 μL in vivo jetPEI 分别稀释在不含内毒素的 5% (wt/vol) 葡萄糖中，混合，配置成400ul注射液。单次 200 μL 注射液以 5分钟的间隔静脉注射两次。注射后48h进行活体成像观察。这里，作者特意选取in vivo jetPEI而非病毒递送，来避免有偏好的全身递送。


结果表明，在所有的模型中，当由pPEG或pGAPE驱动时，可以通过BLI特异性地在肿瘤中检测到荧光素酶，而由pGADD驱动的荧光素酶活性对肿瘤不具有特异性。

最后，作者总结两点突变对于将非癌症特异性pGADD转化为癌症选择性pGAPE至关重要，这种新设计的pGAPE体现了所有必要的功能，使其成为以癌症选择性方式调节转基因表达的理想工具，既可以无创地提供成像剂以跟踪肿瘤促进和转移，又可以创建表达癌症中独特复制功能的CRAD。

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