类器官传代培养全流程及答疑解惑

准备工作
1.仪器设备
CO2 培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅、水浴摇床，医用冰箱、-80°冰箱、移液器（一套）。

2.试剂耗材
小肠类器官培养基，小肠类器官缓冲液、类器官传代消化液、硫酸庆大霉素，双抗，基质胶，60mm细胞培养皿，15ml离心管，1.5ml EP管若干，4度冰盒。

操作流程
1、类器官传代培养之——样本收集
（1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液B放置2min。

（2）移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）。

2、类器官传代培养之——样本消化
A：类器官数量不足或体积较小时：离心5min弃去上清，添加适量小肠类器官缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第3步。

B：类器官数量较多或体积较大时：离心5min弃去上清，添加适量类器官传代消化液D消化2-3min，添加小肠类器官缓冲液终止消化，离心5min弃去混合液，添加适量小肠类器官缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第3步。

3、类器官传代培养之——铺板
类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min添加500μl小肠类器官培养基。

答疑解惑
Q1：类器官培养一代需要多长时间？
答：一般需要5-7天，长得快可3-5天。

Q2: 初始量样本量10*5，活性大于90%，可以培养出多少类器官？
答：培养一代，一般是24孔板的10个孔。

Q3:原代培养中消化下来的细胞是只有干细胞吗？
答：消化下来的细胞包含各个种类的细胞，但是能培养成类器官的只有成体干细胞和肿瘤干细胞，没有干性的细胞在培养过程中不会增殖分化，养的过程会死掉。

Q4：想要CTC培养，需要多少样本量呢？
答：至少50+个CTC，取样时可以多取一些血，CTC细胞占比比较少。

Q5：类器官量多小的时候不需要加消化液？
答：一般是100um以下。

Q6:如果要做药筛需要额外去除基质胶和培养基吗？
答：和传代培养铺板一样，药用培养基稀释就可以。

Q7：类器官培养一定需要基质胶吗？
答：基质胶主要是为类器官提供支撑作用和营养物质，基质胶主要成分有laminin，collagen IV，heparan sulfate proteoglycans。

Q8：取材时为什么剔除脂肪组织？脂肪肝可以做类器官培养吗？
答：脂肪组织影响后续消化分离得到的干细胞纯度，脂肪肝也是可以做类器官培养的，消化前可以多清洗几次，去掉表面脂肪。

Q9：类器官可以直接用细胞系培养吗?
答：用细胞系培养的不能成为类器官，只能称之为细胞球。

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