Advanced Science|皮肤类器官治疗局限性硬皮样病

局限性硬皮样病（Localized Scleroderma，LOS）是一类自身免疫性皮肤疾病，发病率为27/1000000，发病高峰在20~40岁，女性发病率高于男性6倍。越来越多的科研工作者关注于此疾病的研究，探索出有效的治疗策略。

 

作为人体重要的器官，皮肤行使诸多功能：

1.保护 ：保护免受脱水、微生物、创伤、紫外线辐射。

2.感觉 ：感觉和识别疼痛、触摸/压力、温度、热和冷。

3.温度调节 ：释放或保存热量。

4.免疫力 ：皮肤免疫细胞。

5.排泄 ：排出尿酸、氨、尿素和多余的水分。

6.内分泌 ：皮肤有助于维生素D的合成。

7.吸收 ：皮肤能够吸收必要的物质，如氮和氧。

8.防水：皮肤外层覆盖着营养物质和油脂。

 

皮肤中有多种免疫细胞（图1）：朗格汉斯细胞、角质形成细胞、CD8+T细胞、浆细胞样树突状细胞、真皮树突状细胞、CD4+Th1细胞、CD4+Th2细胞、CD4+Th17细胞、γδ细胞、NKT细胞、巨大细胞、巨噬细胞。

 

图1示：皮肤免疫细胞（图片来源：(Nestle, Di Meglio et al. 2009)）

 

当这些免疫细胞识别的抗原来自自身皮肤细胞，造成免疫细胞对健康皮肤细胞的破坏，导致自身免疫性皮肤疾病，例如：硬皮病、银屑藓、大疱性表皮松懈症、大疱性类天疱疮、红斑狼疮、皮肌炎、白塞氏病等。

 

LOS是一种罕见的慢性结缔组织病，主要发生在皮肤和/或下层组织，其特点是皮肤增厚、斑块变形、皮肤坚硬发亮，累及真皮浅层至筋膜和肌肉。它有三个病理特征：血管病变、免疫系统异常和纤维化。在皮损中可以观察到萎缩的汗腺、大疱性皮损和皮层交界处坏死的角质细胞。LOS通常发生在儿童和青少年，平均年龄为4.6-8.7岁。

 

LOS（图2）的遗传因素包括HLA亚型、镶嵌现象、并发自身免疫疾病、自身免疫疾病家族史。表观遗传因素包括：microRNA、组蛋白修饰和DNA甲基化。环境因素包括：精神创伤/手术、反复摩擦、注射/疫苗、昆虫叮咬、射线、药物。角质形成细胞、T细胞活化，产生TGF-β、TNF-α、PDGF、FGF、FLI-1、ET-1、fibrillin-1、α-MSH、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-17、IFN-α、IFN-γ、S100A9。这些因子通过TLR-4导致纤维母细胞增殖。角质形成细胞通过Wnt、Sonic hedgehog和Jagged-Notch信号通路与内皮细胞、纤维母细胞相互作用。内皮细胞活化导致细胞因子和粘附分子的分泌，这些因子进而导致免疫细胞产生纤维化生长因子，刺激成纤维细胞活化、增殖和分化，造成进行性纤维化。

 

图2示LOS发病机制（图片来源：(Snarskaya and Vasileva 2022)）

 

2022年3月22日，中国医学科学院/北京协和医院冷泠，张抒扬及国家应急防控药物工程技术研究中心钟武共同通讯在《Advanced Science》杂志上发表了题为“Application of an iPSC-Derived Organoid Model for Localized Scleroderma Therapy”的研究论文 (Ma, Li et al. 2022)，该研究建立了LOS皮肤的蛋白质组图谱，并对LOS皮肤的病理特征进行了表征，建立了人类诱导的多能干细胞来源的上皮和间充质（EM）类器官模型。

 

通过博莱霉素注射一个月建立了LOS小鼠模型，以模拟其病理特征（图3）。从宏观角度看，皮肤颜色较浅，局限性皮损硬化和萎缩，中心略微凹陷。组织病理学显示真皮层有广泛的坏死，真皮层的胶原束中有密集的炎症浸润物。α平滑肌肌动蛋白（αSMA）、纤维蛋白1（FBN1）和波形蛋白（VIM）在LOS皮肤的真皮层中高度表达，这些蛋白通常用于识别病理性成纤维细胞和肌成纤维细胞。

 

图3示LOS模型构建和病理特征。（图片来源：(Ma, Li et al. 2022)）

 

接下来，用定量蛋白质组学方法来分析LOS皮肤组织的病理特征（图4）。生物学过程分析显示，上调的蛋白质高度富集于肌肉的牵引和发育、肌纤维组装和伤口愈合，包括止血、肌纤维溶解、炎症和免疫反应，表明LOS皮肤表现出肌纤维坏死和炎症浸润。

 

图4示蛋白质组学数据分析结果。（图片来源：(Ma, Li et al. 2022)）

 

应用人类iPSCs来构建类器官（图5）。将iPSCs聚集在U型底96孔板上后，在基质胶中培养这些聚合物，并辅以骨形态发生蛋白4（BMP4）、SB431542（一种TGFβ抑制剂）和碱性成纤维细胞生长因子（FGF），经过3天的分化，用LDN-193189（一种BMP抑制剂）和FGF处理有机体，并在摇床上培养。16天后，组织体表达了外皮标志物（TFAP2A+ECAD+），此外颅骨神经嵴细胞的两个亚型出现了中胚层（PDGFα+）和神经胶质标记（SOX10+P75+）。对此类器官进行单细胞RNA测序，包括8种细胞类型：间充质干细胞、上皮细胞、神经干/祖细胞、神经内皮细胞、神经上皮细胞、神经元、胶质细胞和胚细胞。

 

图5示iPSC来源的EM类器官的构建和细胞学分析。（图片来源：(Ma, Li et al. 2022)）

 

LOS模型小鼠被移植到类器官一个月，对皮肤进行蛋白质组学分析（图6）。在LOS皮肤中上调的蛋白，治疗后下调。这些蛋白在肌肉收缩和发育、肌纤维装配和ATP代谢等生物过程中高度富集，表明肌肉纤维化在类器官治疗后得到有效改善。病理染色结果也显示，类器官治疗后，LOS皮肤组织中的纤维变性标志物（α-SMA、VIM、EN1）表达明显下调，细胞因子（IL1、IL6、IL12、TNFα、CXCL12）表达明显下降。

图6示EM类器官挽救LOS皮肤纤维化和炎症。（图片来源：(Ma, Li et al. 2022)）

 

免疫荧光染色显示（图7）LOS皮肤的成熟表皮标志物（KRT10）和表皮干细胞标志物（KRT14和TP63）的表达水平下降，这些蛋白在治疗组恢复到正常水平。此外，LOS皮肤萎缩的KRT19+汗腺在类器官治疗组比未治疗组恢复到正常水平。类器官治疗后的LOS皮肤组织中的血管也得到了再生。内皮细胞粘附标志物（CD31、ITGB1、MMP9）的表达在治疗组上升。

 

图7示免疫荧光染色结果图和皮肤血管成像。（图片来源：(Ma, Li et al. 2022)）

 

总之，本研究提供了明确的证据，证明应用iPSC衍生的EM类器官可以促进LOS皮肤功能的恢复，从再生医学的角度揭示了治疗LOS新的可行方法。

 

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参考文献：

Ma, J., W. Li, R. Cao, D. Gao, Q. Zhang, X. Li, B. Li, L. Lv, M. Li, J. Jiang, Y. Wang, J. Li, Z. Wu, Y. Zhu, W. Zhong, S. Zhang and L. Leng (2022). "Application of an iPSC-Derived Organoid Model for Localized Scleroderma Therapy." Adv Sci (Weinh) 9(16): e2106075. DOI: 10.1002/advs.202106075.

Nestle, F. O., P. Di Meglio, J. Z. Qin and B. J. Nickoloff (2009). "Skin immune sentinels in health and disease." Nat Rev Immunol 9(10): 679-691. DOI: 10.1038/nri2622.

Snarskaya, E. S. and K. D. Vasileva (2022). "Localized scleroderma: actual insights and new biomarkers." Int J Dermatol 61(6): 667-674. DOI: 10.1111/ijd.15811.